Summary
גזירת מבשרי neuroepithelial מ עובריים (ES) בתאי גזע באמצעות פעילות סטרומה תא הנגזרות גרימת (SDIA).
Abstract
לתאי גזע עובריים יש פוטנציאל להתמיין לתאי מכל שכבות נבט, מה שהופך אותם לכלי אטרקטיבי לפיתוח טיפולים חדשים. באופן כללי, התמיינות של תאים עובריים מלווה את המושג ראשית ליצור ובתאים לא בשלה, אשר לאחר מכן ניתן מופצות הבדיל לתוך פנוטיפים הסלולר בוגרת. זה חל גם על neurogenesis תא הנגזרות ES, שבו את התפתחותם של תאים עצביים בעקבות שני שלבים עיקריים: ראשית, גזירת והרחבת מבשרי neuroepithelial בשלה בידול השני שלהם לתוך תאים עצביים בוגרת. שיטה נפוצה כדי לייצר אבות עצביים מתאי גזע עובריים מבוסס על היווצרות embryoid הגוף (EB), אשר חושף את התמיינות של תאים מכל שכבות נבט כולל neuroectoderm. שיטה חלופית ויעילה יותר כדי לגרום להתפתחות התא neuroepithelial משתמשת פעילות סטרומה תא הנגזרות גרימת (SDIA), אשר ניתן להשיג על ידי שיתוף culturing תאים ES עם מח עצם הגולגולת שמקורם בתאי סטרומה (1). שניהם, היווצרות EB ו SDIA, לחשוף את הפיתוח של רוזטה כמו מבנים, אשר נחשבים דומים עצביים צינור ו / או עצביים לפסגה, כמו אבות. מבשרי עצביים יכולים להיות מבודדים, התרחבה מובחן יותר לתוך נוירונים ספציפיים בתאי גליה תנאי שימוש תרבות מוגדרת. כאן, אנו מתארים את הדור ובידוד של רוזטות כאלה שיתוף תרבות ניסויים עם קו תא סטרומה MS5 (2-5).
Protocol
שלב 1
- Mitomycin-C-פלייט ggrowth עכבות (10 מיקרוגרם / מ"ל במשך 2.5 שעות) MS5 תאים בצפיפות של 70,000 / CM2 על ג'לטין מצופה (0.01% במשך 30 דקות) 6 צלחות היטב α-ממ התקשורת.
- כאשר תאים המחוברים ואת יצרו monolayer (מעל צמיחה לילה), לעבור SRM.
- ידנית לבודד תאים עובריים מושבות של תאים ES תרבויות באמצעות מזרק בעל מחט 27 ½ G.
- Tritrurate המושבות בזהירות עם קצה כחול 1 מ"ל ו צלחת בצפיפות נמוכה על MS5 תאים (בדרך כלל 2-3 מושבות בכל צלחת 6 היטב).
הערה: תאים ES יכולה גם להיות שנלקחו התפשטות אנזימטיות באמצעות collagenase או טריפסין.
שלב 2
- לגדול בתאים עובריים על MS5 ניזונים במשך 14-21 ימים עד ליצור מושבות שושנת המכילים.
הערה: המדיה שינוי לעיתים קרובות. רוזטות הן בדרך כלל בקצוות החיצוניים של המושבות היווצרות שלהם יכול להיות מאוד משופר אם 300-500 ng / ml noggin מתווספת SRM (3). בכמה פרוטוקולים בידול, SRM ניתן להחליף עם N2-מדיה שיושלם עם צמיחה או גורמים אחרים כדי לקדם את המפרט תאים (2-5).
שלב 3
- לבודד לבחור את רוזטות עם 27 ½ G מחט תחת מיקרוסקופ.
הערה: הימנע חיתוך לקטוף את MS5 בתאי סטרומה. אם המושבות עמוסים רוזטות, אפשר גם לבודד את המושבה כולה.
שלב 4
- לשאוב לאשכולות רוזטות, tritrurate אותם בקפידה עם טיפ 1 מ"ל כחול, צלחת אותם על פולי-L-ornithine (0.001%) ו פיברונקטין (1 מיקרוגרם / מ"ל) או laminin (1 מיקרוגרם / מ"ל) מצופה 6 בארות N2-מדיה להשלימו בדרך כלל עם bFGF (20 ng / ml). רוזטות תהיה רפורמה ולהרחיב.
הערה: כדי לשפר את הישרדות התא, אפשר הצלחת אשכולות קטנים טיפות להגדיל את צפיפות התאים. צעד זה גם יכול להיות שונה על ידי השלמת N2-מדיה עם צמיחה נוסף או גורמים אחרים כדי לקדם את המפרט תאים (2-5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מדגים את השלבים השונים ליצירת ובידוד neuroepithelial תאים מתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות SDIA. יישום של שיטה זו הוא סעפת נעשה שימוש בפרוטוקולים רבים לייצר נוירונים המצוין (למשל 1, 2, 5-9). רוזטות נחשבים דומים התאים בצינור העצבי עם פנוטיפ קדמית (2, 5, 10), מכילים גם אבות הרכס העצבי (11, 12). בנוסף, הם שומרים על רמה מסוימת של גמישות, כיוון שהם יכולים להיות בדוגמת על ידי גורמים מסוימים בתנאים תרבות מוגדרת. לפיכך, SDIA הנגזרות אבות עצביים יכול להצמיח סוגי תאים רבים ממערכת העצבים המרכזית היקפי שהופך אותם כלי שימושי הגזירה של אוכלוסיות תאים שונות עצבית בידול פרדיגמות ES התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | ||
| alpha-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12571 | ||
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | ||
| Knockout-DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10829 | ||
| Knockout serum replacement | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | ||
| MEM nonessential amino acid solution | GIBCO, by Life Technologies | 12383 | ||
| DMEM/F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | ||
| N2-A supplement | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich | M0503 | ||
| Gelatine type-A | Sigma-Aldrich | G1890 | ||
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | 0.01% solution | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
| 1 mL Syringe with 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 309623 | ||
| N2-A media | medium | DMEM/F12 + 1% N2-A supplement | ||
| Serum replacement media (SRM) | medium | Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement +1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine | ||
| α-MEM media | medium | α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin | ||
| MS5 | cell line | stromal cells | ||
| Microscope | ||||
| 6-well Plates | for tissue culture |
References
- , Forthcoming.
