Summary
Stromal hücre kaynaklı etkinlik inducing (SDIA) kullanarak embriyonik kök (ES) hücreleri nöroepitelyal öncüleri türetilmesi.
Abstract
Embriyonik kök hücrelerin yeni tedavilerin geliştirilmesi için cazip bir araç haline getirir tüm germ hücreleri ayırt etmek için bir potansiyele sahip. Genel olarak, ES hücrelerinin farklılaşma, daha sonra yayılır ve olgun hücre fenotipleri içine ayırt edilebilir olgunlaşmamış progenitör hücreler, ilk oluşturmak için konsept izler. İlk olarak, olgun sinir hücrelerine olgunlaşmamış nöroepitelyal öncüleri ve ikinci, farklılaşma türetme ve genişleme: Bu aynı zamanda sinir hücrelerinin gelişiminde iki önemli adımlar takip ettiği ES hücre kökenli bir nöron için geçerlidir. Neuroectoderm dahil olmak üzere tüm germ hücreleri farklılaşma ortaya koymaktadır embriyoid gövde (EB) oluşumu, ES hücrelerinin sinir atalarıdır üretmek için ortak bir yöntem dayanmaktadır. Kafatası kemik iliği kaynaklı stromal hücreler (1) ile birlikte kültür ES hücreleri tarafından elde edilebilir stromal hücre kaynaklı etkinlik inducing (SDIA), nöroepitelyal hücre gelişimi neden için alternatif ve daha verimli bir yöntem kullanır. , EB oluşumu ve SDIA Her ikisi de, sinir benzemeye düşünülmektedir rozet benzeri yapıların geliştirilmesi, tüp ve / veya nöral krest gibi atalarıdır ortaya koymaktadır. Sinir öncüleri tanımlı kültür koşulları kullanarak belirli nöronlar ve glia hücreleri içine alacak şekilde genişlemiştir ve daha farklılaşmış, izole edilebilir. Burada, üretim ve izolasyon gibi rozet, stromal hücre hattı MS5 (2-5) ile birlikte kültür deneylerinde açıklar.
Protocol
Adım 1
- Plaka mitomisin-C α-MEM medya jelatin kaplı (30 dakika süreyle% 0.01) 6 kuyucuğu 70.000 / cm2 bir yoğunluk MS5 hücreleri (2,5 saat süreyle 10 mg / ml) ggrowth inhibe.
- Hücreleri eklenir ve bir tek tabaka (gece büyüme üzerinde) oluşmuştur, SRM geçmek.
- Elle olan bir şırınga yardımıyla, 27 ES hücre kültürleri ½ G iğne ES hücre kolonileri izole eder.
- MS5 hücreleri (genellikle 6 plaka başına 2-3 koloni), düşük yoğunluklu 1 ml mavi ucu ve plaka koloniler dikkatle Tritrurate.
Not: Embriyonik kök hücrelerin, aynı zamanda, kollajenaz veya tripsin kullanarak enzimatik yayılma alınabilir.
Adım 2
- Rozet içeren koloniler oluşana kadar 14-21 gün MS5 besleyiciler ES hücreleri büyütün.
Not: Değişim medya sık sık. Rozet, sömürge ve SRM (3) 300-500 ng / ml Noggin eklenirse onların oluşumunu büyük ölçüde artabilir dış kenarları genellikle . Bazı farklılaşma protokolleri, SRM N2-medya ile değiş tokuş edilebilir ve hücre özellikleri (2-5) teşvik etmek için, büyüme ya da diğer faktörler ile desteklenmiş.
Adım 3
- Izole etmek ve rozet almak, 27 ½ G iğne mikroskop altında.
Not: kesme ve MS5 stromal hücreler toplama kaçının. Koloniler rozet dolu, bir de tüm koloni ayırabilirsiniz.
Adım 4
- Aspire rozet, kümeler, poli-L-ornitin (% 0.001) ve fibronektin (1 mcg / ml) veya laminin (1 mcg / ml) kaplı 6 kuyu üzerine 1 ml mavi ucu ve plaka bunları bunları dikkatle tritrurate N2-Bir medya genellikle bFGF (20 ng / ml) ile desteklenmiştir. Rozet reform ve genişleyecektir.
Not: hücre yaşamını geliştirmek için, bir tabak damlacıkları küçük kümeler hücre yoğunluğu artırmak için. Bu adım aynı zamanda, hücre özellikleri (2-5) teşvik etmek için ek bir büyüme ya da diğer faktörler ile N2-Bir medya tamamlayan tarafından değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, SDIA kullanarak insan ES hücrelerinin nöroepitelyal hücreleri üreten ve izole farklı adımları gösteriyor. Bu yöntemin uygulama manifoldu ve belirtilen nöron (örneğin 1, 2, 5-9) üretmek için birçok protokol olmuştur. Rozet anterior fenotip (2, 5, 10) nöral tüp hücreleri benzerler ve aynı zamanda nöral krest atalarıdır (11, 12) içeren düşünülmektedir. Buna ek olarak, belirli faktörler tarafından belirlenen kültür koşulları desenli olabilir çünkü onlar plastisite belirli bir düzeyde muhafaza. Böylece, onlara ES hücre farklılaşması paradigmalar farklı sinir hücre popülasyonlarının türetme için yararlı bir araç haline merkezi ve periferik sinir sistemi, SDIA türevli sinir atalarıdır birçok hücre tiplerinin yol verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | ||
| alpha-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12571 | ||
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | ||
| Knockout-DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10829 | ||
| Knockout serum replacement | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | ||
| MEM nonessential amino acid solution | GIBCO, by Life Technologies | 12383 | ||
| DMEM/F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | ||
| N2-A supplement | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich | M0503 | ||
| Gelatine type-A | Sigma-Aldrich | G1890 | ||
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | 0.01% solution | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
| 1 mL Syringe with 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 309623 | ||
| N2-A media | medium | DMEM/F12 + 1% N2-A supplement | ||
| Serum replacement media (SRM) | medium | Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement +1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine | ||
| α-MEM media | medium | α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin | ||
| MS5 | cell line | stromal cells | ||
| Microscope | ||||
| 6-well Plates | for tissue culture |
References
- , Forthcoming.
