Summary
भ्रूण स्टेम (ते) stromal उत्प्रेरण सेल व्युत्पन्न गतिविधि (SDIA) का उपयोग कोशिकाओं से neuroepithelial व्यापारियों की व्युत्पत्ति.
Abstract
ES कोशिकाओं सभी रोगाणु परतें, जो उन्हें नए उपचारों के विकास के लिए एक आकर्षक उपकरण बनाती से कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता है. सामान्य में, ES कोशिकाओं की भेदभाव की अवधारणा का अनुसरण करने के लिए पहली बार अपरिपक्व पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं, जो तब और प्रचारित किया जा सकता है परिपक्व सेलुलर phenotypes में भेदभाव उत्पन्न. यह भी ES neurogenesis सेल व्युत्पन्न के लिए लागू होता है, तंत्रिका कोशिकाओं के विकास में जो दो प्रमुख चरणों में निम्न प्रकार है: पहले, व्युत्पत्ति और परिपक्व तंत्रिका कोशिकाओं में विस्तार अपरिपक्व neuroepithelial व्यापारियों और दूसरे, उनके भेदभाव के. एक सामान्य विधि ES कोशिकाओं से तंत्रिका progenitors उत्पादन embryoid शरीर (EB) के गठन, जो neuroectoderm सहित सभी रोगाणु परतें से कोशिकाओं की भिन्नता से पता चलता है पर आधारित है. Neuroepithelial सेल के विकास को प्रेरित करने के लिए एक वैकल्पिक और अधिक कुशल पद्धति stromal उत्प्रेरण सेल व्युत्पन्न (SDIA) गतिविधि है, जो सह संवर्धन खोपड़ी की हड्डी मज्जा stromal कोशिकाओं व्युत्पन्न (1) के साथ ES कोशिकाओं के द्वारा प्राप्त किया जा सकता का उपयोग करता है. दोनों EB गठन और SDIA, थाली की तरह संरचनाओं के विकास, ट्यूब और जो तंत्रिका सदृश करने के लिए लगा रहे हैं / या तंत्रिका शिखा की तरह progenitors प्रकट करते हैं. तंत्रिका व्यापारियों, अलग किया जा सकता है विस्तार और विशिष्ट न्यूरॉन्स और glia कोशिकाओं परिभाषित संस्कृति शर्तों का उपयोग करने में आगे विभेदित. यहाँ, हम पीढ़ी और stromal सेल MS5 लाइन (2-5) के साथ सह संस्कृति प्रयोगों में ऐसे rosettes के अलगाव का वर्णन.
Protocol
चरण 1
- Mitomycin सी प्लेट (10 / 2.5 घंटे के लिए μg मिलीलीटर) ggrowth जिलेटिन लेपित (30 मिनट के लिए 0.01%) α सदस्य मीडिया में 6 अच्छी तरह प्लेटें पर 70,000 / cm2 के घनत्व पर MS5 कोशिकाओं हिचकते.
- जब कोशिकाओं को संलग्न कर रहे हैं और एक monolayer (रात वृद्धि पर) का गठन, SRM स्विच.
- ES सेल 27 के साथ एक सिरिंज का उपयोग कर संस्कृतियों आधा जी सुई से मैन्युअली ES सेल कालोनियों को अलग.
- एक 1 मिलीलीटर नीले टिप और MS5 कोशिकाओं (आमतौर पर 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति 2-3 कालोनियों) पर थाली कम घनत्व के साथ कालोनियों सावधानी Tritrurate.
नोट: ES कोशिकाओं एंजाइमी collagenase या trypsin का उपयोग प्रचार से भी लिया जा सकता है है .
चरण 2
- MS5 भक्षण पर ES कोशिकाओं थाली युक्त कालोनियों फार्म तक 14-21 दिनों के लिए आगे बढ़ें.
नोट: अक्सर बदलें मीडिया. rosettes कालोनियों और उनके गठन बहुत अगर 300-500 नोगिन एनजी / एमएल SRM (3) करने के लिए जोड़ा जाता है बढ़ाया जा सकता के बाहरी किनारों पर आम तौर पर कर रहे हैं. कुछ भेदभाव प्रोटोकॉल में, SRM N2-एक मीडिया के साथ विमर्श किया जा सकता है और विकास या अन्य कारकों के लिए सेल विनिर्देश (2-5) को बढ़ावा देने के साथ पूरक.
चरण 3
- पृथक और 27 एक साथ लेने rosettes आधा एक खुर्दबीन के नीचे जी सुई.
नोट: काटने और MS5 stromal कोशिकाओं उठा से बचें . यदि कालोनियों rosettes के साथ पैक कर रहे हैं, एक भी पूरी कॉलोनी को अलग कर सकते हैं.
चरण 4
- Rosettes के समूहों Aspirate, उन्हें सावधानी से tritrurate एक 1 मिलीलीटर नीले टिप, पाली (0.001%) - एल ओर्निथिन और fibronectin (1 μg / एमएल) या laminin (1 μg / एमएल) 6 कुओं में लेपित और उन्हें थाली के साथ N2-एक मीडिया आमतौर पर bFGF (20 एनजी / एमएल) के साथ पूरक है. rosettes सुधार और विस्तार होगा.
नोट: सेल अस्तित्व को बढ़ाने की थाली, एक बूंदों में छोटे समूहों सेल घनत्व में वृद्धि कर सकते हैं . यह कदम भी अतिरिक्त विकास या अन्य कारकों के लिए सेल विनिर्देश (2-5) को बढ़ावा देने के साथ N2 एक मीडिया सप्लीमेंट द्वारा संशोधित किया जा सकता है.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल पैदा करने और मानव ES SDIA का उपयोग कोशिकाओं से neuroepithelial कोशिकाओं में अलग अलग चरणों को दर्शाता है. इस विधि का आवेदन कई गुना है और कई प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया है निर्दिष्ट न्यूरॉन्स का उत्पादन (1 उदाहरण के लिए, 2, 09/05) है. rosettes के लिए एक पूर्वकाल phenotype (2, 5, 10) के साथ न्यूरल ट्यूब कोशिकाओं सदृश और भी तंत्रिका शिखा progenitors (11, 12) होते हैं लगा रहे हैं. इसके अलावा, वे plasticity की एक निश्चित स्तर को बनाए रखने के बाद से वे परिभाषित संस्कृति परिस्थितियों में विशिष्ट कारकों द्वारा नमूनों किया जा सकता है. इस प्रकार, SDIA व्युत्पन्न तंत्रिका progenitors वृद्धि मध्य और परिधीय तंत्रिका प्रणाली उन्हें अलग ES सेल भेदभाव मानदंड में तंत्रिका कोशिका आबादी की व्युत्पत्ति के लिए एक उपयोगी उपकरण बनाने से कई प्रकार की कोशिकाओं के लिए दे सकते हैं.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | ||
| alpha-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12571 | ||
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | ||
| Knockout-DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10829 | ||
| Knockout serum replacement | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | ||
| MEM nonessential amino acid solution | GIBCO, by Life Technologies | 12383 | ||
| DMEM/F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | ||
| N2-A supplement | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich | M0503 | ||
| Gelatine type-A | Sigma-Aldrich | G1890 | ||
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | 0.01% solution | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
| 1 mL Syringe with 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 309623 | ||
| N2-A media | medium | DMEM/F12 + 1% N2-A supplement | ||
| Serum replacement media (SRM) | medium | Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement +1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine | ||
| α-MEM media | medium | α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin | ||
| MS5 | cell line | stromal cells | ||
| Microscope | ||||
| 6-well Plates | for tissue culture |
References
- , Forthcoming.
