Summary
Wyprowadzenie nabłonka prekursorów z zarodkowych komórek macierzystych (ES) komórki za pochodzące z komórek podścieliska działalności wywołujących (SDIA).
Abstract
Komórek ES mają możliwość różnicowania się komórek ze wszystkich listków zarodkowych, co czyni je atrakcyjnym narzędziem do rozwoju nowych terapii. Ogólnie rzecz biorąc, różnicowania komórek ES następujące pojęcia najpierw wygenerować niedojrzałe komórki progenitorowe, które następnie mogą być propagowane i zróżnicowane w dojrzałych komórek fenotypy. Dotyczy to również ES pochodzące z komórek nerwowych, w którym rozwój komórek nerwowych na dwa główne etapy: po pierwsze, pochodzenie i rozwój niedojrzałych prekursorów nabłonka i drugim, ich różnicowanie się w dojrzałe komórki nerwowe. Powszechną metodą produkcji nerwowych komórek progenitorowych z komórek ES jest oparta na embryoid ciała (EB) formacja, która ujawnia różnicowanie komórek ze wszystkich listków zarodkowych w tym neuroectoderm. Alternatywnych i bardziej efektywna metoda rozwoju komórek nabłonka wywoływać wykorzystuje pochodzące z komórek podścieliska działalności wywołujących (SDIA), które można osiągnąć przez wspólne hodowanie komórek ES z kości czaszki pochodzące ze szpiku komórki podścieliska (1). Zarówno tworzenie EB i SDIA, ujawniają rozwoju struktur rozeta-podobne, które są uważane przypominają cewy nerwowej i / lub grzebienia nerwowego-jak przodkowie. Prekursorów komórek nerwowych mogą być izolowane, rozszerzone i dalsze zróżnicowane w specyficzne neurony i komórki gleju za pomocą określonych warunkach hodowli. Poniżej opiszemy w zakresie wytwarzania i izolacji takich rozet współpracy kultury eksperymenty z linii komórek podścieliska MS5 (2-5).
Protocol
Krok 1
- Płyta mitomycyna-C ggrowth hamowanej (10 mg / ml do 2,5 godziny) MS5 komórek przy gęstości 70000 / cm2 żelatyna powlekane (0,01% przez 30 minut) 6 płyt oraz w α-MEM mediów.
- Gdy komórki są związane i tworzą monowarstwy (ponad wzrostu noc), przejdź do SRM.
- Ręcznie izolować kolonie komórek ES z hodowli komórek ES za pomocą strzykawki z igłą 27 G ½.
- Tritrurate kolonii dokładnie z 1 ml końcówka niebieski i płytki w niskiej gęstości na MS5 komórek (zwykle 2-3 kolonie na 6 i płyty).
Uwaga: Komórki ES mogą być również pobrane od enzymatycznej propagacji za pomocą kolagenazy lub trypsyny.
Krok 2
- Wzrost komórek ES na MS5 podajniki do 14-21 dni do rozety zawierających tworzyć kolonie.
Uwaga: media często się zmieniają. Rozety są zazwyczaj na zewnętrznych krawędziach kolonii i ich tworzenie może być znacznie większe, gdyby 300-500 ng / ml kubek jest dodawany do SRM (3). W niektórych protokołów zróżnicowanie, SRM mogą być wymieniane z N2-mediów i uzupełnione wzrostu lub innych czynników promowanie specyfikacji komórki (2-5).
Krok 3
- Wyizolować i wybrać rozety z 27 ½ igły G pod mikroskopem.
Uwaga: Należy unikać cięcia i zbieranie MS5 komórki podścieliska. Jeśli kolonie są pakowane z rozetami, można również izolować całej kolonii.
Krok 4
- Zaaspiruj grup rozety, tritrurate ostrożnie z 1 niebieski ml końcówki, a płyta je poli-L-ornityny (0,001%) i fibronektyny (1 mg / ml) lub lamininy (1 mg / ml) powlekane 6 studni w N2-media zwykle uzupełnione bFGF (20 ng / ml). Rozety będzie reform i rozszerzenia.
Uwaga: Aby zwiększyć przeżywalność komórek, można płyty małych klastrów w kropelki w celu zwiększenia gęstości komórek. Ten krok może być modyfikowane poprzez dodanie N2-mediów, dodatkowy wzrost lub inne czynniki promowanie specyfikacji komórki (2-5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokół ten pokazuje różne etapy w tworzeniu i izolowanie komórki nabłonka nerwowego z ludzkich komórek ES pomocą SDIA. Zastosowanie tej metody jest wieloraki i jest stosowany w wielu protokołów do produkcji określonych neuronów (np. 1, 2, 5-9). Uważa się, że rozety przypominają komórki nerwowe rury z przednim fenotyp (2, 5, 10), a także zawierać neuronowych przodków szczytu (11, 12). Ponadto, zachowują pewien stopień plastyczności, ponieważ mogą one być wzorowane przez szczególne czynniki w określonych warunkach hodowli. Tak więc, SDIA pochodzenia nerwowego przodków może prowadzić do wielu typów komórek ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego co czyni je przydatnym narzędziem do pozyskiwania różnych populacji komórek nerwowych w paradygmaty ES różnicowania się komórek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | ||
| alpha-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12571 | ||
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | ||
| Knockout-DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10829 | ||
| Knockout serum replacement | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | ||
| MEM nonessential amino acid solution | GIBCO, by Life Technologies | 12383 | ||
| DMEM/F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | ||
| N2-A supplement | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich | M0503 | ||
| Gelatine type-A | Sigma-Aldrich | G1890 | ||
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | 0.01% solution | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
| 1 mL Syringe with 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 309623 | ||
| N2-A media | medium | DMEM/F12 + 1% N2-A supplement | ||
| Serum replacement media (SRM) | medium | Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement +1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine | ||
| α-MEM media | medium | α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin | ||
| MS5 | cell line | stromal cells | ||
| Microscope | ||||
| 6-well Plates | for tissue culture |
References
- , Forthcoming.
