Summary
Het cDNA microarray PtGen2 is ontwikkeld voor genexpressie studies in loblolly pine,
Abstract
PtGen2 is een kenmerk 26496 cDNA microarray met versterkte loblolly grenen EST's. De array wordt geproduceerd in ons laboratorium voor gebruik door onderzoekers bestuderen van genexpressie in dennen en andere naaldbomen. PtGen2 werd ontwikkeld als een resultaat van onze ontdekking van genen inspanningen in loblolly grenen, en bestaat uit sequenties geïdentificeerd in de eerste plaats van de wortel weefsels, maar ook van de naald en de stengel. 1,2 PtGen2 is getest door het hybridiseren van verschillende gelabelde Cy-dye conifeer doel cDNA , waarbij zowel versterkt en niet-versterkte indirecte labeling methoden, en ook getest met een aantal van de hybridisatie en het wassen voorwaarden. Deze video richt zich op de behandeling en verwerking van dia's voor en na de pre-hybridisatie, als na hybridisatie, met behulp van enkele aanpassingen aan de procedures eerder ontwikkelde. 3,4 Ook inbegrepen, in tekst vorm, zijn de protocollen die gebruikt worden voor het opwekken, etikettering en de clean-up van de doelstelling cDNA's, evenals informatie over de software die wordt gebruikt voor de downstream-verwerking van gegevens.
PtGen2 is bedrukt met een eigen afdruk buffer die hoge concentraties van het zout dat kan moeilijk zijn om volledig te verwijderen bevat. De dia's worden eerst gewassen in een warme SDS-oplossing voorafgaand aan de pre-hybridisatie. Na de pre-hybridisatie, worden de dia's krachtig gewassen in een aantal wijzigingen van het water om de verwijdering van de resterende zouten te voltooien. LifterSlips ™ worden vervolgens gereinigd en geplaatst op de dia's en gelabeld cDNA wordt zorgvuldig geladen op de microarray door middel van capillaire werking, die voorziet in een gelijkmatige verdeling van de steekproef over de glijbaan, en vermindert de kans van de zeepbel van oprichting. Hybridisatie van doelstellingen om de array wordt gedaan bij 48 ° C in een hoge luchtvochtigheid. Na hybridisatie wordt een reeks van standaard wasbeurten gedaan op 53 ° C en kamertemperatuur voor langere tijden. Verwerking PtGen2 dia's met deze techniek minder zout en SDS-afgeleide artefacten vaak gezien als de array is minder rigoureus verwerkt. Hybridiserende doelen die afgeleid zijn uit verschillende bronnen conifeer RNA, deze verwerking protocol leverde minder artefacten, minder achtergrond, en op voorwaarde dat een betere samenhang tussen de verschillende experimentele groepen van arrays.
Protocol
(Let op de artikelen 1 tot 4 niet aangetoond in Video)
Voorbereiden van Cy-gelabeld cDNA Target
Wat volgt is het protocol waarin we voor cDNA synthese gebruik van loblolly dennen totaal RNA en indirecte cDNA etikettering voorafgaand aan de hybridisaties microarray. Hoewel een enkele niet-triviale wijzigingen zijn aangebracht, het protocol hieronder is vergelijkbaar met die in de handleiding die bij SuperScript Indirecte van de Invitrogen's cDNA Labeling Kit.
Deel 1: eerste streng cDNA synthesereactie
- Mix en kort elke kit component draaien voor gebruik.
- Bereid reacties als volgt:
- Xμl DEPC-H 2 O
- Xμl totaal RNA, 20 pg / reactie (voorbehandeld met Turbo DNase Ambion's)
- 2μl Verankerd oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl)
- 1μl Random hexameer Primer
- Totaal Volume = 18μl
- Incubeer buisjes bij 70 ° C gedurende 5 minuten, en plaats dan op ijs gedurende 1-2 minuten.
- Voeg de volgende aan elke reactie buisje op ijs:
- 6μl 5X eerste streng buffer
- 1.5μl 0,1 M DTT
- 1.5μl 10 mM dNTP mix
- 1μl RNaseOUT (40U/μl)
- 2μl SuperScript III RT (400U/μl)
- Meng voorzichtig en spin kort. 'S nachts Incubeer buis bij 45 ° C.
- Voeg 15μl van 1M NaOH om elke reactie buis en meng goed.
- Incubeer buis bij 70 ° C gedurende 10 minuten.
- Voeg 15μl van 1M HCl, meng voorzichtig.
- Voeg 20μl 3M natriumacetaat (pH 5,2), meng voorzichtig.
Deel 2: Reinigend eerste streng cDNA.
- Voeg 500μl van laden Buffer naar het cDNA (vanaf stap 1.9) en meng goed.
- Plaats een SNAP Purification Column (meegeleverd met de Indirect Etikettering kit) op een verzamelbuis en laad je cDNA op de kolom.
- Spin bij 14.000 g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut en schenk de flow-through.
- Plaats de SNAP Column op dezelfde collectie buis en voeg 500μl van Wash Buffer.
- Spin bij 14.000 g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut en schenk de flow-through.
- Herhaal de stappen 2.4 en 2.5 drie keer, voor een totaal van drie 500μl wasbeurten.
- Spin nog een keer bij 14.000 g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut seconden; gooi de flow-through.
- Plaats de SNAP Column op een nieuwe 1,5 ml buis.
- Voeg 50μl van warm DEPC-water (50 ° C) om de SNAP Column en incubeer column bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. Elueer het cDNA via een spin bij 14.000 g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut.
- Herhaal stap 2.9, met behulp van 100μl van warm DEPC-water en dezelfde 1,5 ml buis voor het eluens.
- Voeg 20μl van 3M natriumacetaat (pH 5,2) om het eluens van de stappen 2.9 en 2.10.
- Voeg 3μl van glycogeen (20mg/ml) om de buis en meng.
- Voeg 500μl van ijskoude 100% EtOH, meng goed, en incubeer de buis gedurende 1 uur bij -80 ° C.
- Spin de buis op 14.000 g bij 4 ° C gedurende 20 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant.
- Voeg 500μl van ijskoude 70% EtOH en spin de buis op 14.000 g bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant.
- De lucht drogen van het monster gedurende 5 minuten; ervoor zorgen dat alle EtOH wordt verwijderd.
- Verwarm de 2X Coupling buffer bij 37 ° C gedurende 5 minuten en de cDNA monster opnieuw te schorten in 5μl van warme 2X Koppeling Buffer.
- Verwarm de cDNA / Coupling buffer bij 50 ° C gedurende 10 minuten en vortex goed. Zorg ervoor dat uw cDNA pellet volledig wordt opnieuw gesuspendeerd in de 2X Koppeling Buffer.
Deel 3: Etikettering met fluorescerende kleurstof
Bij de voorbereiding van de reactie, wees dan voorzichtig om de blootstelling van de kleurstof oplossing aan het licht te minimaliseren. Ook DMSO is hygroscopisch en zal vocht uit de lucht, die reageren met de NHS ester van de kleurstof en een aanzienlijke vermindering van de koppeling reactie-efficiëntie. Houd de DMSO in de kit geleverd in een amberkleurige schroef-capped flesje bij -20 ° C, en laat de flacon op kamertemperatuur voordat u deze opent om condensatie te voorkomen. Gebruik alleen de DMSO die bij deze kit.
- Open een pakje van Cy-3 of Cy-5 Dye en direct toe te voegen 75μl van DMSO aan de kleurstof flacon.
- Voeg 5μl van de DMSO / kleurstof oplossing om de buis van stap 2.18.
- Meng goed en incubeer het buisje bij kamertemperatuur in het donker gedurende 1 uur.
- Voeg 20μl van 3M natriumacetaat (pH 5,2) om de kleurstof-gekoppelde cDNA-oplossing.
- Voeg 500μl van laden Buffer naar het cDNA-oplossing. Meng goed door vortexen.
- Plaats een SNAP Column op een duidelijke verzameling buis en laadt de cDNA / bufferoplossing.
- Spin bij 14.000 g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut en schenk de flow-through.
- Plaats de SNAP Column op dezelfde collectietube en voeg 500μl van Wash Buffer naar kolom.
- Spin bij 14.000 g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut en schenk de flow-through.
- Herhaal stap 3. 8-3,9 drie keer, voor een totaal van drie 500μl wasbeurten.
- Spin nog een keer bij 14.000 g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut en schenk de flow-through.
- Plaats de SNAP Column op een nieuwe oranje collectie buis.
- Voeg 65μl van warm DEPC-water (50 ° C) om de SNAP Column en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut.
- Spin bij 14.000 g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut en het verzamelen van de doorstroming. De flow-through moet bevatten 60μl van uw gezuiverde dye-gekoppelde cDNA.
Deel 4: Het beoordelen van de Labeling procedure.
- Voer een spectrofotometer test aan elke Cy-cDNA labeling te beoordelen. Bereken het totale aantal pmol van de gesynthetiseerde cDNA: [OD 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg] / 324,5 pg / pmol. Bereken de totale pmol van opgenomen Cy-Dye voor elke etikettering reactie: pmol Cy3 = [OD 550 X vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [OD 650 X vol.] / 0,25. Vervolgens berekent de pmol van nucleotide / pmol dye-ratio voor elke reactie. Optimale reacties genereren> 6000pmol van cDNA (per 60ul),> 200pmol van Cy-Dye (per 60ul), en een nucleotide / kleurstof verhouding die is <30.
Deel 5: Schuif Pre-Wash
- De PtGen2 Array is gedrukt op Corning UltraGaps dia's (amino-silaan gecoat) en cDNA's zijn UV-cross-linked. Print plekken zijn duidelijk zichtbaar door het hoge zoutgehalte van de buffer.
- Gebruik een diamant tip pen aan de glijbaan voor de bovenste en onderste delen van het afdrukgebied (optioneel) te markeren.
- Zet ongeveer 250mL voorverwarmde tot 43 ° C 0,2% SDS oplossing in microscoopglaasje wassen schotel (3 "x 4").
- Plaats de glaasjes te pre-gehybridiseerd in de dia rek en duik in het SDS-oplossing 15-20 keer zeer krachtig om de zouten te verwijderen op de dia's.
- Met behulp van een tang, verwijder voorzichtig de dia's uit het rek en plaats ze in een Coplin pot met Pre-hybridisatie Buffer (5x SSC, 0,1% SDS, 1% BSA), die is voorverwarmd tot 43 ° C. Incubeer bij 43 ° C gedurende ten minste een uur.
Deel 6: Pre-hybridisatie
- Stel vijf slide afwas, elk gevuld met millipure dH 2 O, en een Coplin pot gevuld met moleculair-biologische kwaliteit isopropanol. Plaats de objectglaasjes in een rack en proces achtereenvolgens vijf gerechten door dunking 20 keer per stuk.
- Verwijder de dia's twee tegelijk uit de vijfde water wassen en dip 5-6 keer in de isopropanol en onmiddellijk plaats in dia's in de slide microfuge (Chipmate benchtop, 2 posities) en spin 1 minuut om te drogen.
- Schoon dia's met perslucht gefilterd door een 0,22 urn filter cartridge en plaats deze met de streepjescode naar boven in een Genomic Solutions Hybridization Kamer.
- Schoon LifterSlips ™ met gefilterde lucht en plaats ze op de dia's met de witte strips naar beneden. Gebruik een geel pipet tip om voorzichtig uitlijnen van de lifter slip op de dia (wassen LifterSlips ™ eerst in 70% ethanol is optioneel. We hebben gemerkt dat het niet nodig is.)
Deel 7: hybridisatie
Moeten worden uitgevoerd in het donker of bij weinig licht.
- Voor elke dia worden gehybridiseerd, berekent het bedrag van Cy-5 en Cy-3 gemerkte cDNA tot 50-75pmol van elk doel te geven. Combineer die bedragen in een enkele buis en in een vacuüm exsiccator met de hitte-instelling droog bij 37-45 ° C. Voorkomen dat ze uitdrogen compleet!
- Resuspendeer de gedroogde probes in 60ml hybridisatiebuffer (vers gemaakt die dag) en vortex kort.
- Incubeer de geresuspendeerde cDNA 5 minuten in een 95 ° C en vervolgens snel microfuge gedurende 30 seconden.
- Laad de hele gehersuspendeerd sonde volume door het langzaam pipetteren op de slide-LifterSlip ™ kruising onderaan (streepjescode einde) van de dia. De dia zal laden door middel van capillaire werking. (Sommigen geven de voorkeur aan on pipet om de dia en dan zachtjes de overlay LifterSlip ™ is dit een one shot methode want als je bellen kunt u de LifterSlip ™ niet bewegen na plaatsing wat kan leiden tot versmering artefacten spot)
- Plaats 20uL van 100mm DTT in elke vochtigheid goed gelegen aan de uiteinden van de kamer.
- Plaats de top op de kamer en draai de nok schroeven. Bedek de kamer met aluminiumfolie en onder te dompelen in een 48 ° C waterbad voor 12-18 uur zacht schudden op 50-60 rpm.
Deel 8: Post-hybridisatie Wast
Alle gewassen moeten worden uitgevoerd in het donker of bij weinig licht. Dia's mogen nooit worden toegestaan om te drogen tot de laatste stap.
- Stel een Coplin pot gevuld met Wash Solution # 1 @ 53 ° C, en vier schuif afwassen gevuld met 250 ml van elk van de volgende: 1) Wash Oplossing # 1 @ 53 ° C, 2) Was Oplossing # 2 @ kamertemperatuur, 3 & 4) twee gerechten met wassen Oplossing # 3 @ kamertemperatuur.
- Verwijder voorzichtig de dia's van de hybridisatie kamers en plaats ze twee tegelijk in de Coplin pot. Laat gedurende 30 seconden, til de schuif langzaam en de tillift slip blijft in de pot. Plaats de glaasjes in de glijbaan rack en onmiddellijk onder te dompelen in Wash Solution # 1 (1X SSC, 0,2% SDS, verwarm tot 43 ° C). Herhaal dit totdat alle LifterSlips zijn verwijderd en alle dia's te worden gewassen in de Wash Solution # 1 schotel. Duik rack op en neer 10 keer krachtig.
- Plaats schotel in 53 ° C in lucht shaker met schudden bij 50-100 toeren per minuut gedurende 10 minuten.
- Overdracht rek naar Oplossing # 2 (0.1X SSC, 0,2% SDS), dompelbad 10 keer, en incubeer wassen bij kamertemperatuur langzaam schudden gedurende 10 minuten.
- Dip rack 15 keer in de eerste Wash Solution # 3 (0.1X SSC) te verwijderen eventueel resterende SDS over te dragen van de Wash Solution # 2. Plaats rek in de tweede Wash Solution # 3 schotel, dompelbad 10 keer, en dan langzaam schudden gedurende 10 minuten.
- Plaats de glaasjes in 50 ml Falcon buizen afgedekt en spin @ 1500 rpm in centrifuge is uitgerust met een swingende emmer rotor. Verwijder de dia's om gerezen container licht, gebruiken we een andere Falcon buis bekleed met aluminiumfolie, en zuiveren de lucht uit de buis met stikstofgas, dop stevig vast (dit vermindert de oxidatie van de Cy kleurstoffen, in het bijzonder Cy-5 in de zomer, wanneer ozonconcentraties het hoogst ). Dia's kunnen worden opgeslagen voor een paar uur voor het scannen in de stikstof gespoeld buizen, maar de beste signaal resultaten worden verkregen bij het scannen gebeurt onmiddellijk na het wassen.
Deel 9: verzamelen van gegevens en statistische analyse
- Scan beeldgegevens is verzameld op een PerkinElmer ScanArray. We maken gebruik van een 10 micron scaninstelling en balans Cy3 en Cy5 signalen met behulp van de lijn methode voor de aanpassing volgens de instructies van de fabrikant.
- TIF-bestanden zijn gerasterde en ruwe signaal data verzameld en gefilterd met ImaGene Version 7.5 (BioDiscovery, Inc, El Segundo, CA)
- Data normalisatie en evaluatie om statistisch verantwoorde differentieel tot expressie soort te bepalen wordt gedaan met BRB Array tools Ver. 3.7.
- Patroon analyse tot bepaling van de coördinerend uitgedrukte genen te vergemakkelijken wordt gedaan met Gene Expression Pattern Analysis Software (GEPAS) Ver. 3.1.
Figuur 1. Voorbeeld van verwerkte PtGen2 array met deze protoco l.
Figuur 2. Voorbeeld van PtGen2 reeks verwerkt met behulp van standaard-hybridisatie en het wassen van protocollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PtGen2 is een recent ontwikkeld, op maat cDNA microarray, dat is ontworpen om in de eerste plaats worden gebruikt door de loblolly dennen onderzoeksgemeenschap. Generated voorlopige resultaten tot nu toe hebben aangetoond dat het array een waardevol instrument voor de evaluatie van transcriptionele gebeurtenissen die zich voordoen in respons op droogtestress, evenals bij het toezicht op wijzigingen die tijdens de ontwikkeling van het embryo zich in de maritieme dennen, Pinus pinaster 5,6 We worden Ook onlangs aangetoond dat PtGen2 goed werkt in cross soorten hybridisaties met behulp van een doelsteekproef geïsoleerd uit een brede waaier van coniferen geslachten. 5 Omdat PtGen2 steeds meer gebruikt door onderzoekers van het bestuderen van genexpressie in Pinus en andere naaldbomen, deze training video moet hen te voorzien van de nodige technische basis om de kwaliteit en reproduceerbare gegevens te genereren. In onze handen, PtGen2 leverde betere resultaten worden verwerkt door meer stringente hybridisatie en het wassen van protocollen dan die meestal werkzaam in microarray werk. Andere benaderingen van het verwerken van de PtGen2 reeks waren succesvol, maar miste consistentie. Na de technische stappen die hier beschreven zal helpen om de consistentie te verhogen, vooral bij het verwerken van grote aantallen van arrays, en zal ook helpen om sterk te verminderen en ongewenste artefacten en een hoge achtergronden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De etikettering, hybridisatie en het wassen van protocollen hierin bevatten enkele wijzigingen die eerder ontwikkeld door Dr J. Quackenbush terwijl bij het Institute for Genomic Research (TIGR), Dr Shawn Levy aan de Vanderbilt Microarray Shared Resource (VMSR), en Dr rob Alba terwijl het Boyce Thompson Instituut, (BTI) Cornell University.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
| Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
| Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
| Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
| Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
| Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma-Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50mL Conical Tubes | Other | Falcon BD | 352070 | |
| 15mL Conical Tubes | Other | Falcon BD | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
| Coplin Jar | Wheaton | 900520 | ||
| Staining Dish & Rack | Other | Wheaton | 900200 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Other | Sigma-Aldrich | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen | L1014-02 | |
| Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
| System | ||||
| Cy-5 Dye | Reagent | GE Healthcare | PA25001 | |
| Cy-3 Dye | Reagent | GE Healthcare | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Other | Erie Scientific | 25X601 | |
| HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |
References
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
- Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).
- Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. August 25-29, Quebec City, Quebec, , (2008).
- Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. September 24-27, Albena, Bulgaria, , (2008).
