Summary
Die cDNA-Microarray PtGen2 war für die Genexpression Studien in loblolly Kiefer entwickelt,
Abstract
PtGen2 ist ein 26.496-Funktion cDNA-Microarray mit verstärkten loblolly Kiefer ESTs. Das Array wird in unserem Labor für die Nutzung durch Forscher studieren die Genexpression in Kiefern und andere Nadelhölzer hergestellt. PtGen2 wurde als Ergebnis unserer Bemühungen zur Entdeckung von Genen in loblolly Kiefer entwickelt und wird von Sequenzen in erster Linie aus Wurzelgewebe identifiziert umfasst, sondern auch aus Nadel-und Stammzellen. 1,2 PtGen2 durch Kreuzungen verschiedener Cy-Farbstoff markiert Nadelbaum Ziel cDNAs wurde getestet , wobei sowohl verstärkt und nicht verstärkt indirekte Markierung Methoden und auch mit einer Reihe von Hybridisierung und Waschen Bedingungen getestet. Dieses Video konzentriert sich auf die Handhabung und Verarbeitung von Folien vor und nach dem Pre-Hybridisierung, sowie nach der Hybridisierung mit einigen Modifikationen der Verfahren entwickelt zuvor. 3,4 Ebenfalls enthalten in Textform nur, sind die Protokolle für die Erzeugung, Kennzeichnung und Reinigung von Ziel-cDNA s, sowie Informationen über Software für Downstream-Verarbeitung verwendet.
PtGen2 ist mit einem proprietären Druckpuffer, dass hohe Konzentrationen von Salz, die nur schwer vollständig zu entfernen Dose enthält gedruckt. Die Folien werden zunächst in einem warmen SDS-Lösung vor pre-Hybridisierung gewaschen. Nach einer Vorauswahl Hybridisierung werden die Objektträger kräftig in mehrere Änderungen des Wasser gewaschen, um das Entfernen der restlichen Salze abzuschließen. LifterSlips ™ werden dann gereinigt und positioniert auf den Folien und markierte cDNA wird vorsichtig auf dem Mikroarray durch Kapillarwirkung, die für eine gleichmäßige Verteilung der Probe auf den Objektträger bietet geladen, und verringert die Chance von bubble Statuten. Hybridisierung von Zielen auf das Array wird bei 48 ° C bei hoher Luftfeuchtigkeit durchgeführt. Nach der Hybridisierung wird eine Reihe von Standard-Wäschen bei 53 ° C durchgeführt und Raumtemperatur für längere Zeit. Verarbeitung PtGen2 Dias mit dieser Technik reduziert Salz und SDS-derived Artefakte oft gesehen, wenn das Array weniger streng verarbeitet wird. Hybridisierende Ziele aus verschiedenen Koniferen RNA Quellen stammen, ergab diese Verarbeitung Protokoll weniger Artefakte, reduziert Hintergrund, und sofern eine bessere Konsistenz zwischen den verschiedenen experimentellen Gruppen von Arrays.
Protocol
(Hinweis Abschnitte 1 bis 4 nicht in Video demonstriert)
Vorbereitung Cy-markierten Target-cDNA
Was folgt, ist das Protokoll, die wir für die cDNA-Synthese aus loblolly Kiefer Gesamt-RNA und indirekten cDNA Kennzeichnung vor Hybridisierungen Microarray. Obwohl ein paar nicht-triviale Änderungen vorgenommen wurden, ist das Protokoll unter ähnlich wie in der Bedienungsanleitung SuperScript Indirekte die Invitrogen cDNA Labeling Kit zur Verfügung gestellt.
Teil 1: First-Strand cDNA Synthesis Reaction
- Mix und kurz Spin jedes Kit-Komponenten vor der Verwendung.
- Bereiten Sie Reaktionen wie folgt:
- Xμl DEPC-H 2 O
- Xμl Gesamt-RNA, 20 ug / Reaktion (vorbehandelt mit Turbo DNase Ambions)
- 2μl Anchored Oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl)
- 1μl Zufällige Hexamer Primer
- Gesamtvolumen = 18μl
- Die Röhrchen bei 70 ° C für 5 Minuten, und dann auf Eis für 1-2 Minuten.
- Fügen Sie die folgenden zu jedem Reaktionsgefäß auf Eis:
- 6μl 5X First-Strand-Puffer
- 1.5μl 0,1 M DTT
- 1.5μl 10mM dNTP-Mix
- 1μl RNaseOUT (40U/μl)
- 2μl SuperScript III RT (400U/μl)
- Vorsichtig mischen und Spin kurz. Inkubieren Rohr über Nacht bei 45 ° C.
- Add 15μl 1M NaOH zu jedem Reaktionsgefäß geben und gut mischen.
- Inkubieren Rohr bei 70 ° C für 10 Minuten.
- Fügen Sie 15μl von 1M HCl; vorsichtig mischen.
- Add 20 &mgr; l 3 M Natriumacetat (pH 5,2); vorsichtig mischen.
Teil 2: Reinigung von First-Strand cDNA.
- Fügen Sie 500μl der Ladepuffer der cDNA (aus Schritt 1,9) und gut mischen.
- Legen Sie eine SNAP Purification Column (im Lieferumfang des Indirect Labeling Kit) auf einem Sammelrohr und laden Sie Ihre cDNA auf der Säule.
- Spin bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute; entsorgen Sie die Flow-Through.
- Legen Sie die SNAP Spalte auf der gleichen Sammlung Rohr und fügen 500μl Waschpuffer.
- Spin bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute; entsorgen Sie die Flow-Through.
- Wiederholen Sie die Schritte 2,4 und 2,5 dreimal für insgesamt drei 500μl wäscht.
- Spin noch einmal bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute sec; entsorgen Sie die Flow-Through.
- Legen Sie die SNAP Column auf ein neues 1,5 ml Tube.
- Add 50 ul warmen DEPC-Wasser (50 ° C) auf die SNAP Column und inkubieren Spalte bei Raumtemperatur für 1 Minute. Eluieren der cDNA über eine Spin bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute.
- Wiederholen Sie Schritt 2,9, mit 100 &mgr; l warmes DEPC-Wasser und die gleiche 1.5ml tube für den Eluenten.
- Add 20 &mgr; l 3 M Natriumacetat (pH 5,2) zum Eluenten aus den Schritten 2,9 und 2,10.
- Add 3μl von Glykogen (20mg/ml), um das Rohr und mischen.
- Fügen Sie 500μl eiskaltem 100% EtOH, gut mischen und inkubieren das Rohr 1 Stunde bei -80 ° C.
- Drehen Sie das Rohr bei 14.000 g bei 4 ° C für 20 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
- Fügen Sie 500μl eiskaltem 70% EtOH und drehen Sie das Rohr bei 14.000 g bei 4 ° C für 5 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
- Der Luft trocknen die Proben für 5 Minuten; sicherzustellen, dass alle EtOH entfernt wird.
- Warm 2X Coupling Buffer bei 37 ° C für 5 Minuten und Resuspension der cDNA-Probe in 5μl der warmen 2X Coupling Buffer.
- Erhitzen Sie die cDNA / Coupling-Puffer bei 50 ° C für 10 Minuten und Vortex gut. Stellen Sie sicher, dass Ihr cDNA Pellet vollständig in den 2X Coupling Buffer resuspendiert.
Teil 3: Markierung mit Fluoreszenzfarbstoff
Bei der Vorbereitung der Reaktion vorsichtig sein, um die Exposition der Farbstofflösung, um Licht zu minimieren. Außerdem ist DMSO hygroskopisch und zieht Feuchtigkeit aus der Luft, die mit dem NHS-Ester des Farbstoffes reagieren und reduzieren die Kupplungsreaktion Effizienz absorbieren. Halten Sie das DMSO im Kit in einer bernsteinfarbenen Schraubverschluss Fläschchen bei -20 ° C geliefert, und lassen Sie das Fläschchen auf Raumtemperatur erwärmt, bevor um Kondensation zu vermeiden. Verwenden Sie nur das DMSO mit diesem Kit zur Verfügung gestellt.
- Öffnen Sie ein Paket von Cy-3-oder Cy-5 Dye und fügen 75μl DMSO direkt an den Farbstoff Durchstechflasche.
- Add 5μl der DMSO / Farblösung in die Röhre aus Schritt 2.18.
- Gut mischen und inkubieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur im Dunkeln für 1 Stunde.
- Add 20 &mgr; l 3 M Natriumacetat (pH 5,2), um den Farbstoff gekoppelten cDNA-Lösung.
- Fügen Sie 500μl der Ladepuffer der cDNA-Lösung. Gut mischen durch Vortexen.
- Legen Sie eine SNAP Spalte auf eine klare Sammelröhrchen und laden Sie die cDNA / Puffer-Lösung.
- Spin bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute; entsorgen Sie die Flow-Through.
- Legen Sie die SNAP Spalte auf der gleichen KollektionRohr, fügen Sie 500μl Waschpuffer in Spalte.
- Spin bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute; entsorgen Sie die Flow-Through.
- Wiederholen Sie die Schritte 3. 8-3,9 dreimal für insgesamt drei 500μl wäscht.
- Spin noch einmal bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute; entsorgen Sie die Flow-Through.
- Legen Sie die SNAP Spalte auf eine neue Bernstein-Collection-Tube.
- Fügen Sie 65μl der warmen DEPC-Wasser (50 ° C) auf die SNAP-Säule und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Minute.
- Spin bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute und sammeln Sie die Flow-Through. Die Flow-Through sollte 60μl des gereinigten Farbstoff-gekoppelten cDNA.
Teil 4: Beurteilung der Labeling Verfahren.
- Conduct einem Spektralphotometer Test zu jeder Cy-cDNA Kennzeichnung zu bewerten. Berechnen Sie die Gesamtzahl der pmol der synthetisierten cDNA: [OD 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg] / 324,5 pg / pmol. Berechnen Sie die gesamte pmol eingebaut Cy-Farbstoff für jede Kennzeichnung Reaktion: pmol Cy3 = [OD 550 X vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [OD 650 X vol.] / 0,25. Als nächstes berechnen die pmol Nukleotid / pmol Farbstoff-Verhältnis für jede Reaktion. Optimal Reaktionen erzeugen> 6000pmol der cDNA (pro 60ul),> 200pmol von Cy-Dye (pro 60ul) und ein Nukleotid / Farbstoff-Verhältnis, das <30 ist.
Teil 5: Schieben Sie Pre-Wash
- Die PtGen2 Array basiert auf Corning UltraGaps Dias (Amino-Silan beschichtet) gedruckt und cDNAs sind UV-vernetzt. Print Flecken sind deutlich sichtbar durch den hohen Salzgehalt des Puffers.
- Verwenden Sie ein Diamant-Spitze Feder, um die Folie für den oberen und unteren Bereich der Print-Bereich (optional) zu markieren.
- Legen Sie etwa 250 ml bis 43 vorgewärmten ° C 0,2% SDS-Lösung in Objektträger waschen Teller (3 "x 4").
- Die Objektträger in der Bildschirmpräsentation Rack und tauchen Sie ein in die SDS-Lösung 15-20 Mal sehr heftig, um die Salze auf den Folien zu entfernen vorhybridisiert werden.
- Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen die Dias aus dem Rack und legen Sie sie in einem Coplin Gefäß mit Pre-Hybridisierungspuffer (5x SSC, 0,1% SDS, 1% BSA), die wurde auf 43 ° C vorgewärmten Inkubation bei 43 ° C für mindestens eine Stunde.
Teil 6: Pre-Hybridisierung
- Set fünf schieben Abwasch mit jeweils millipure dH 2 O gefüllt, und ein Coplin Glas mit molekularen grade Isopropanol gefüllt. Legen Sie die Folien in einer Bildschirmpräsentation Rack-und Prozess nacheinander durch fünf Gerichte, die von dunking 20-mal jeweils.
- Die Objektträger zwei auf einmal aus dem fünften Wasser waschen und Dip 5-6 mal in der Isopropanol und sofort in Folien in die Folie Mikrofuge (Chipmate Tischgerät, 2 Positionen) und Spin 1 Minute, um zu trocknen.
- Saubere Objektträger mit Druckluft durch ein 0,22 um Filterpatrone gefiltert und legen Sie sie mit dem Strichcode nach oben in einem Genomic Solutions Hybridisierung Kammer.
- Saubere LifterSlips ™ mit gefilterter Luft und positionieren sie auf dem Objektträger mit den weißen Streifen nach unten. Verwenden Sie eine gelbe Pipettenspitze vorsichtig ausrichten Heber slip on the slide (Washing LifterSlips ™ zunächst in 70% Ethanol ist optional. Wir haben es nicht für erforderlich.)
Teil 7: Hybridisierung
Sollte sich in der Dunkelheit oder schlechten Lichtverhältnissen durchgeführt werden.
- Für jede Folie hybridisiert werden, berechnen die Höhe der Cy-5 und Cy-3 markierten cDNA-bis 50-75pmol der einzelnen Zielgruppen zu geben. Kombinieren Sie diese Beträge in einem einzigen Rohr und trocken in einem Vakuum-Exsikkator mit der Hitze Einstellung bei 37-45 ° C. Vermeiden Trocknung vollständig aus!
- Resuspendieren der getrockneten Proben in 60 ml Hybridisierungspuffer (frisch zubereitet an diesem Tag) und kurz vortexen.
- Inkubieren Sie die resuspendiert cDNAs für 5 Minuten in ein 95 ° C-Bad und dann schnell Mikrozentrifuge für 30 Sekunden.
- Laden Sie das gesamte resuspendiert Sonde Volumen langsam Pipettieren bei der Dia-LifterSlip ™ Kreuzung an der Unterseite (Strichcode) Ende der Rutsche. Die Folie wird mittels Kapillarwirkung zu laden. (Einige ziehen es vor Pipette auf den Objektträger und dann vorsichtig überlagern die LifterSlip ™ ist dies ein one shot-Verfahren, da, wenn Sie Blasen bekommt man nicht bewegen kann der LifterSlip ™ nach der Platzierung, die zu verschmieren Artefakte Spot kann)
- Legen Sie 20ul von 100 mM DTT in jedes gut Feuchtigkeit an den Enden der Kammer befindet.
- Legen Sie die oben an der Kammer und ziehen Sie die cam Schrauben. Decken Sie die Kammer mit Aluminiumfolie und tauchen Sie ein in eine 48 ° C Wasserbad für 12-18 Stunden unter leichtem Rühren bei 50-60 Umdrehungen pro Minute.
Teil 8: Post-Hybridisierung Wäscht
Alle Wäschen sollte in der Dunkelheit oder schlechten Lichtverhältnissen durchgeführt werden. Folien sollte nie erlaubt, bis zum letzten Schritt zu trocknen.
- Richten Sie einen Coplin Glas mit Wash Solution # 1 @ 53 ° C und vier Schlitten Abwasch mit 250 ml jeder der folgenden gefüllt: 1) WAsche Lösung # 1 @ 53 ° C, 2) Waschlösung # 2 @ Raumtemperatur, 3 & 4) zwei Schalen mit Waschlösung # 3 @ Raumtemperatur.
- Entfernen Sie vorsichtig die Folien aus der Hybridisierung Kammern und legen Sie sie zwei auf einmal in die Coplin Glas. Lassen Sie für 30 Sekunden, dann heben Sie die Folie langsam und der Heber Schlupf wird in das Glas zu bleiben. Objektträger in die Dia-Rack und sofort tauchen Sie ein in Waschlösung # 1 (1X SSC, 0,2% SDS, Vorwärmung auf 43 ° C). Wiederholen, bis alle LifterSlips entfernt werden und alle Folien, gewaschen werden in der Waschlösung Nr. 1 Schüssel. Tauchen Sie ein Rack nach oben und unten 10 mal kräftig.
- Legen Gericht in 53 ° C in Luft Schüttler Schütteln bei 50-100 rpm für 10 Minuten.
- Transfer-Rack-Lösung # 2 (0,1 × SSC, 0,2% SDS), stürzen 10 Mal, und bei Raumtemperatur inkubieren Wash, langsamen Schütteln für 10 Minuten.
- Dip-Rack 15-mal in der ersten Waschlösung # 3 (0,1 X SSC) zu entfernen, restliche SDS Übertrag aus der Waschlösung # 2. Legen Zahnstange in der zweiten Waschlösung Nr. 3 Schüssel stürzen 10 Mal, und dann langsam Schütteln für 10 Minuten.
- Die Objektträger in 50 mL Falcon Röhrchen mit und Spin @ 1.500 Umdrehungen pro Minute in der Zentrifuge mit Ausschwingrotor ausgestattet. Entfernen Sie Folien geprüft Container Licht, verwenden wir einen anderen Falcon-Röhrchen mit Alufolie abgedeckt, und die Luft aus der Röhre mit Stickstoffgas, fest verschließen (geht auf die Oxidation des Cy-Farbstoffe, insbesondere Cy-5 im Sommer, wenn die Ozonwerte am höchsten sind ). Dias können für ein paar Stunden vor dem Scannen in den Stickstoff gespült Rohre gelagert werden, aber das beste Signal Ergebnisse werden erzielt, wenn Scan unmittelbar nach dem Waschen fertig ist.
Teil 9: Datenerhebung und statistische Analyse
- Scan Bilddaten auf einem PerkinElmer ScanArray gesammelt. Wir verwenden eine 10-Mikron-Scan-Einstellung und Balance Cy3 und Cy5-Signale über die Line-Methode zur Anpassung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- TIF-Dateien sind gerasterten und Rohsignal Daten gesammelt und mit ImaGene Version 7,5 (BioDiscovery, Inc., El Segundo, CA) filtriert
- Daten Normalisierung und Auswertung, um statistisch gültige differentiell exprimierten Arten zu bestimmen, ist mit BRB Array-Tools Ver getan. 3.7.
- Pattern-Analyse zur Bestimmung der koordinativ exprimierten Genen zu erleichtern ist mit Genexpressionsmuster Analysis Software (GEPAS) Ver getan. 3.1.
Abbildung 1. Beispiel PtGen2 Array verarbeitet Verwendung dieses Protokolls in l.
Abbildung 2. Beispiel PtGen2 Array verarbeitet unter Verwendung von Standard-Hybridisierung und Waschen Protokolle.
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Discussion
PtGen2 ist eine neu entwickelte, individuelle cDNA-Microarray, die entworfen, um in erster Linie durch die loblolly Kiefer Forschung verwendet werden sollte. Vorläufige Ergebnisse generiert bislang haben das Array gezeigt, dass ein wertvolles Hilfsmittel bei der Bewertung der Transkriptions-Ereignisse, die in Reaktion auf Trockenstress auftreten, sowie bei der Überwachung der Veränderungen, die während der Embryonalentwicklung entstehen in Pinien, Pinus pinaster 5,6 Wir haben auch kürzlich gezeigt, dass PtGen2 funktioniert gut im Querschnitt Arten Hybridisierungen mit Zielstichproben aus einem vielfältigen Angebot von Nadelbaum Gattungen isoliert. 5 Wie PtGen2 immer mehr von den Forschern studiert Genexpression in Pinus und anderen Nadelbaumarten genutzt, dieses Video-Training sollten sie mit den erforderlichen Finanzmitteln technische Basis zu generieren Qualität und reproduzierbare Daten. In unseren Händen, ergab PtGen2 bessere Ergebnisse, wenn sie durch strengere Hybridisierung und Waschen Protokolle als die üblicherweise in Microarray-Arbeit beschäftigt verarbeitet. Andere Ansätze zur Bearbeitung der PtGen2 Array erfolgreich gewesen aber es fehlte die Konsistenz. Nach der technischen hier beschriebenen Schritte helfen, um die Konsistenz zu erhöhen, insbesondere bei der Verarbeitung einer großen Anzahl von Arrays, und wird auch zu einer deutlichen Verringerung und Beseitigung unerwünschter Artefakte und hohe Hintergründen.
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Acknowledgments
Die Kennzeichnung, Hybridisierung und Waschen Protokolle hierin enthalten einige Änderungen an, die zuvor von Dr. J. Quackenbush während der Institute for Genomic Research (TIGR), Dr. Shawn Levy an der Vanderbilt Microarray Shared Resource (VMSR) entwickelt, und Dr. Rob Alba während der Boyce Thompson Institute (BTI) Cornell University.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
| Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
| Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
| Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
| Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
| Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma-Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50mL Conical Tubes | Other | Falcon BD | 352070 | |
| 15mL Conical Tubes | Other | Falcon BD | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
| Coplin Jar | Wheaton | 900520 | ||
| Staining Dish & Rack | Other | Wheaton | 900200 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Other | Sigma-Aldrich | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen | L1014-02 | |
| Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
| System | ||||
| Cy-5 Dye | Reagent | GE Healthcare | PA25001 | |
| Cy-3 Dye | Reagent | GE Healthcare | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Other | Erie Scientific | 25X601 | |
| HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |
References
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- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
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