Summary
O cDNA microarray PtGen2 foi desenvolvido para estudos de expressão gênica em mudas de pinus,
Abstract
PtGen2 é um microarray de cDNA contendo funcionalidade 26.496 ESTs pinheiros loblolly amplificada. A matriz é produzido em nosso laboratório a ser utilizado por pesquisadores que estudam a expressão gênica em espécies de coníferas de pinheiros e outras. PtGen2 foi desenvolvido como resultado de nossos esforços gene descoberta em pinheiro, e é composta de seqüências identificadas principalmente a partir de tecidos de raiz, mas também de agulha e tronco 1,2. PtGen2 foi testado por hibridação diferentes Cy dye-rotulados cDNAs alvo de coníferas , usando tanto amplificadas e não amplificadas métodos de rotulagem indireta, e também testados com uma série de condições de hibridização e lavagem. Este vídeo enfoca a manipulação e processamento de slides antes e após a pré-hibridização, bem como após a hibridização, utilizando-se algumas modificações para os procedimentos desenvolvidos anteriormente 3,4. Também estão incluídos, em forma de texto único, são os protocolos utilizados para a geração, rotulagem e limpeza de cDNA s alvo, bem como informações sobre o software usado para processamento de dados a jusante.
PtGen2 é impresso com um buffer de impressão proprietária que contém altas concentrações de sal que pode ser difícil de remover completamente. As lâminas são lavadas primeiro em uma solução SDS quente antes de pré-hibridização. Após a pré-hibridização, as lâminas são lavadas vigorosamente em várias mudanças de água para completar a remoção dos sais remanescentes. LifterSlips ™ são limpos e, em seguida, posicionado na slides e rotulado cDNA é cuidadosamente carregado no microarray por meio de ação capilar que prevê a distribuição uniforme da amostra em todo o slide, e reduz a chance de incorporação de espuma. Hibridação de metas para a matriz é feita a 48 ° C em condições de alta umidade. Após a hibridização, uma série de lavagens padrão são feitas a 53 ° C e temperatura ambiente por longos períodos. Processamento PtGen2 slides usando esta técnica reduz o sal ea SDS-artefatos derivados muitas vezes visto quando a matriz é processada menos rigorosa. Hibridação alvos derivado de várias fontes diferentes de coníferas RNA, este protocolo de processamento rendeu menos artefatos, fundo reduzida, e desde uma maior consistência entre os diferentes grupos experimentais de matrizes.
Protocol
(Nota Seções 1 - Não 4 demonstraram em Vídeo)
Preparando Cy-alvo identificadas cDNA
O que se segue é o protocolo que usamos para a síntese de cDNA a partir de RNA total de pinus taeda e rotulagem cDNA microarray indireta antes hibridizações. Apesar de alguns não-trivial modificações foram feitas, o protocolo abaixo é semelhante ao que no manual de instruções fornecido com o Kit Invitrogen de Etiquetagem SuperScript indireta cDNA.
Parte 1: First-Strand reação de síntese de cDNA
- Misture e brevemente girar cada componente do kit antes de usar.
- Prepare reacções como se segue:
- Xμl DEPC-H 2 O
- Xμl total de RNA, 20 mg / reação (pré-tratados com DNase Turbo é Ambion)
- Ancorado 2μl Oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl)
- Primer Hexamer 1μl Aleatório
- Volume Total = 18μl
- Incubar os tubos a 70 ° lugar C por 5 minutos, e depois em gelo durante 1-2 minutos.
- Adicione o seguinte a cada tubo de reação sobre o gelo:
- 6μl tampão Strand-First 5X
- 1.5μl 0,1 M DTT
- 1.5μl 10mM dNTP mix
- 1μl RNaseOUT (40U/μl)
- 2μl SuperScript III RT (400U/μl)
- Misture delicadamente e girar rapidamente. Incube o tubo durante a noite a 45 ° C.
- Adicionar 15μl de NaOH 1M para cada tubo de reacção e misture bem.
- Incube o tubo a 70 ° C por 10 minutos.
- Adicionar 15μl de 1M HCl; misture delicadamente.
- Adicionar 20μl de acetato de sódio 3M (pH 5,2) e misturar delicadamente.
Parte 2: Purificação de First-Strand cDNA.
- Adicionar 500μl de tampão de carregamento para o cDNA (a partir do Passo 1.9) e misturar bem.
- Colocar uma coluna de purificação SNAP (fornecido com o kit Labeling indireta) em um tubo de coleta e carregar o seu cDNA na coluna.
- Giram a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto; descartar o escoamento.
- Coloque a coluna no tubo SNAP mesma coleção e adicionar 500μl de tampão de lavagem.
- Giram a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto; descartar o escoamento.
- Repita os passos 2.4 e 2.5 três vezes, para um total de três lavagens 500μl.
- Girar mais uma vez a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto seg; descartar o escoamento.
- Coloque a coluna SNAP para um novo tubo de 1,5 ml.
- Adicionar 50μl de água DEPC quente (50 ° C) para a Coluna SNAP e coluna incubar a temperatura ambiente por 1 minuto. Eluir o cDNA através de um giro em 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto.
- Repita o passo 2.9, utilizando 100μl de água DEPC quente e mesmo tubo 1,5 ml do eluente.
- Adicionar 20μl de acetato de sódio 3M (pH 5,2) para o eluente das etapas 2.9 e 2.10.
- Adicionar 3μl de glicogênio (20mg/ml) para o tubo e misturar.
- Adicionar 500μl de etanol gelado 100%, misture bem e incubar os tubos durante 1 hora a -80 ° C.
- Girar o tubo a 14.000 g a 4 ° C por 20 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante.
- Adicionar 500μl de etanol gelado 70% e girar o tubo a 14.000 g a 4 ° C por 5 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante.
- Secar a amostra por 5 minutos; assegurar que todos os EtOH é removido.
- Aquecer o tampão de acoplamento 2X a 37 ° C por 5 minutos e voltar a suspender a amostra cDNA em 5μl de tampão de acoplamento quente 2X.
- Aqueça o buffer / cDNA Coupling a 50 ° C por 10 minutos e vortex bem. Garantir que o seu pellet cDNA é totalmente re-suspenso no buffer de acoplamento 2X.
Parte 3: Rotulagem com corante fluorescente
Ao preparar a reação, tenha cuidado para minimizar a exposição da solução de corante à luz. Além disso, DMSO é higroscópico e absorve a umidade do ar, que vai reagir com o éster NHS do corante e reduzir significativamente a eficiência da reação de acoplamento. Manter o DMSO fornecido no kit em um frasco com tampa de rosca âmbar a -20 ° C, e deixe o frasco à temperatura ambiente antes de abrir para evitar a condensação. Use apenas o DMSO fornecidos com este kit.
- Abra um pacote de Cy-3 ou Cy-5 Dye e adicionar 75μl de DMSO diretamente para o frasco do corante.
- Adicionar 5μl da solução de DMSO / tintura para o tubo de Passo 2,18.
- Misture bem e incubar os tubos em temperatura ambiente no escuro por uma hora.
- Adicionar 20μl da 3M acetato de sódio (pH 5,2) para a solução corante-coupled cDNA.
- Adicionar 500μl de tampão de carregamento para a solução de cDNA. Misture bem em vórtice.
- Coloque uma coluna SNAP em um tubo de coleta clara e carregue a solução de cDNA / buffer.
- Giram a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto; descartar o escoamento.
- Coloque a coluna SNAP na mesma coleçãotubo, adicionar 500μl de tampão de lavagem para a coluna.
- Giram a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto; descartar o escoamento.
- Repita os passos 3. 8-3,9 três vezes, para um total de três lavagens 500μl.
- Girar mais uma vez a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto; descartar o escoamento.
- Coloque a coluna SNAP para um novo tubo de recolha de âmbar.
- Adicionar 65μl de água DEPC quente (50 ° C) para a Coluna SNAP e incubar à temperatura ambiente por 1 minuto.
- Giram a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto e recolher o escoamento. O fluxo através deverá conter 60μl de sua purificada dye-coupled cDNA.
Parte 4: Avaliar o procedimento de etiquetagem.
- Realizar um ensaio de espectrofotômetro para avaliar cada rotulagem Cy-cDNA. Calcular o número total de pmol de cDNA sintetizado: [OD 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg] / 324,5 pg / pmol. Calcular o total de pmol incorporados Cy-Dye para cada reação rotulagem: pmol Cy3 = [OD 550 X vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [OD 650 X vol.] / 0,25. Em seguida, calcular o pmol de nucleótidos / pmol relação de corante para cada reação. Reações ótima gerar> 6000pmol de cDNA (por 60ul),> 200pmol de Cy-Dye (por 60ul), e uma relação de nucleótidos / corante que é <30.
Parte 5: Slide de pré-lavagem
- O Array PtGen2 é impresso em slides Corning UltraGaps (amino-silano revestido) e cDNAs são UV-reticulado. Pontos de impressão são claramente visíveis devido ao alto teor de sal do buffer.
- Use uma caneta de ponta de diamante para marcar o slide para as áreas superiores e inferiores da área de impressão (opcional).
- Coloque cerca de 250mL pré-aquecido a 43 ° C 0,2% de solução SDS em microscópio de lavar prato de slides (3 "x 4").
- Colocar as lâminas de ser pré-hibridizada no rack de slides e mergulhe na solução de SDS 15-20 vezes muito vigorosamente para remover os sais nos slides.
- Usando pinça, retire cuidadosamente os slides da prateleira e colocá-los em um frasco contendo tampão de hibridização Coplin Pré-(SSC 5X, SDS 0,1%, BSA 1%) que foi pré-aquecido a 43 ° C. Incubar a 43 ° C por pelo menos uma hora.
Parte 6: Pré-hibridação
- Criar cinco pratos de slides de lavar roupa, cada uma preenchida com millipure dH 2 O, e um frasco cheio de Coplin molecular grau isopropanol. Colocar as lâminas em um rack de slides e processo sequencial através de cinco pratos com dunking 20 vezes cada.
- Retirar as lâminas duas de cada vez a partir da lavagem com água e mergulhe quinta 5-6 vezes no lugar isopropanol e imediatamente em slides na microcentrífuga slide (de bancada Chipmate, 2 posições) e spin 1 minuto para secar.
- Slides limpa com ar comprimido filtrado através de um cartucho de filtro de 0,22 mM e colocá-los com o código de barras virado para cima em uma Câmara Genomic Solutions hibridação.
- LifterSlips Clean ™ com ar filtrado e posicioná-los nos slides com as tiras brancas voltada para baixo. Use a ponta da pipeta amarelo para alinhar suavemente o deslizamento levantador no slide (lavar LifterSlips ™ primeiro em etanol 70% é opcional. Descobrimos que ele seja desnecessário.)
Parte 7: Hibridização
Deve ser realizada à luz escura ou baixa.
- Para cada slide a ser hibridizado, calcular a quantidade de Cy-5 e Cy-3 rotulado cDNA para dar 50 75pmol de cada alvo. Combine os montantes em um único tubo e seca num exsicador de vácuo com a configuração de calor em 37-45 ° C. Evite secar completamente!
- Volte a suspender as sondas secas em tampão de hibridação 60mL (feito fresco naquele dia) e brevemente vortex.
- Incubar a cDNAs ressuspenso por 5 minutos em um banho de 95 ° C e depois de microcentrífuga rápida por 30 segundos.
- Carregue o volume de sonda por toda ressuspenso lentamente na pipetagem o slide LifterSlip-junção ™ na parte inferior (fim do código de barras) do slide. O slide será carregado por meio de ação capilar. (Alguns preferem pipeta para o slide e então suavemente sobrepor a LifterSlip ™ este é um método um tiro, pois se você ficar bolhas você não pode mover o ™ LifterSlip após a colocação que pode levar a manchas local artefatos)
- 20uL lugar de DTT 100mM em cada umidade bem localizado nas extremidades da câmara.
- Coloque a parte superior da câmara e aperte os parafusos cam. Cobrir a câmara com folha de alumínio e mergulhe em um banho de água 48 ° C por 12-18 horas, com agitação suave a 50-60 rpm.
Parte 8: Pós-hibridação Lava
Todas as lavagens devem ser realizadas à luz escura ou baixa. Slides nunca deve ser deixada para secar até a etapa final.
- Criar um jar Coplin preenchido com solução de lavagem # 1 @ 53 ° C, e quatro pratos de slides de lavar cheia de 250mL de cada um dos seguintes: 1) Wash Solução # 1 @ 53 ° C, 2) Solução de Lavagem # 2 @ temperatura ambiente, 3 e 4) dois pratos contendo solução de lavagem # 3 @ temperatura ambiente.
- Remova cuidadosamente os slides das câmaras de hibridação e coloque-os dois de uma vez dentro do frasco Coplin. Deixe descansar por 30 segundos, em seguida, levante a deslizar para fora lentamente e os slip levantador permanecerá na jarra. Colocar as lâminas em porta-lâminas e imediatamente mergulhe na solução de lavagem # 1 (1X SSC, 0,2% SDS, pré-aqueça a 43 ° C). Repita até que todos LifterSlips são removidos e todas as lâminas a serem lavadas na solução de lavagem # 1 prato. Mergulhe em rack cima e para baixo 10 vezes vigorosamente.
- Coloque no prato de 53 ° C no ar shaker com agitação 50-100 rpm em 10 minutos.
- Transferência de rack para Solução de lavagem # 2 (0,1 x SSC, 0,2% SDS), mergulhe 10 vezes, e incubar à temperatura ambiente, lenta agitação por 10 minutos.
- Dip em rack de 15 vezes para a solução de lavagem primeira # 3 (0,1 x SSC) para remover qualquer SDS residual transitar de Solução de Lavagem # 2. Rack de lugar na solução de lavagem segunda # 3 prato, mergulhar 10 vezes, e em seguida lenta agitação por 10 minutos.
- Colocar as lâminas em 50 mL tubos Falcon nivelado e girar @ 1.500 rpm em centrífuga equipado com um rotor de caçamba móvel. Retirar as lâminas à luz recipiente à prova, usamos um outro tubo de Falcon coberto com papel alumínio e ar de purga do tubo com gás nitrogênio, tampa bem (o que reduz a oxidação dos corantes Cy, especialmente Cy-5 no verão, quando os níveis de ozônio são mais elevados ). Lâminas podem ser armazenadas por algumas horas antes da digitalização nos tubos de nitrogênio purgado, no entanto, melhores resultados são obtidos quando sinal de digitalização é feito imediatamente após a lavagem.
Parte 9: Coleta de Dados e Análise Estatística
- Dados de imagem de verificação é recolhida em um ScanArray PerkinElmer. Nós usamos uma configuração de digitalização de 10 micra e equilíbrio Cy3 e Cy5 sinais utilizando o método de ajuste da linha de acordo com as instruções do fabricante.
- TIF são grade e dados de sinal primas coletadas e filtradas com ImaGene Versão 7.5 (Biodiscovery, Inc., El Segundo, CA)
- Normalização de dados e avaliação para determinar estatisticamente espécie válida diferencialmente expressos é feito com ferramentas de matriz BRB Ver. 3.7.
- Análise de padrões para facilitar a determinação de genes expressos coordenadamente é feito com Gene Software Análise de Expressão de Padrão (GEPAS) Ver. 3.1.
Figura 1. Exemplo de PtGen2 série processados usando este l. Protoco
Figura 2. Exemplo de PtGen2 série processados usando hibridização e protocolos padrão de lavar roupa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PtGen2 é um recentemente desenvolvido, personalizado microarray de cDNA, que foi projetado para ser usado principalmente pela comunidade de pesquisa loblolly pinho. Os resultados preliminares gerados até o momento têm demonstrado a matriz para ser uma ferramenta valiosa na avaliação de eventos transcricionais que ocorrem em resposta ao estresse hídrico, bem como no monitoramento das mudanças que ocorrem durante o desenvolvimento do embrião no pinheiro bravo, Pinus pinaster 5,6 Temos também demonstrou recentemente que PtGen2 funciona bem em hibridizações de espécies cruzadas utilizando amostras alvo isolados a partir de uma gama diversificada de gêneros de coníferas. 5 Como PtGen2 torna-se mais utilizado por pesquisadores que estudam a expressão do gene em Pinus e outras espécies de coníferas, este vídeo de treinamento deve proporcionar-lhes a necessária base técnica para gerar dados de qualidade e reprodutíveis. Em nossas mãos, PtGen2 rendeu melhores resultados quando tratados por mais de hibridização rigorosos e protocolos de lavar roupa do que as normalmente empregadas no trabalho de microarray. Outras abordagens para o processamento da matriz PtGen2 têm sido bem sucedidas, mas faltava consistência. Seguindo os passos técnicos descritos aqui vai ajudar a aumentar a coerência, principalmente durante o processamento de um grande número de matrizes, e também ajudará a reduzir e eliminar os artefatos indesejados e backgrounds alta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
A rotulagem, a hibridização, e protocolos de lavar aqui contêm algumas modificações para os desenvolvidos anteriormente pelo Dr. J. Quackenbush enquanto no The Institute for Genomic Research (TIGR), Dr. Shawn Levy no Microarray Vanderbilt Shared Resource (VMSR), e Dr. Rob Alba, enquanto no Boyce Thompson Institute (BTI) Cornell University.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
| Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
| Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
| Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
| Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
| Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma-Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50mL Conical Tubes | Other | Falcon BD | 352070 | |
| 15mL Conical Tubes | Other | Falcon BD | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
| Coplin Jar | Wheaton | 900520 | ||
| Staining Dish & Rack | Other | Wheaton | 900200 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Other | Sigma-Aldrich | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen | L1014-02 | |
| Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
| System | ||||
| Cy-5 Dye | Reagent | GE Healthcare | PA25001 | |
| Cy-3 Dye | Reagent | GE Healthcare | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Other | Erie Scientific | 25X601 | |
| HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |
References
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
- Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).
- Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. August 25-29, Quebec City, Quebec, , (2008).
- Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. September 24-27, Albena, Bulgaria, , (2008).
