עיבוד פיין Loblolly PtGen2 cDNA microarray

Summary

CDNA microarray PtGen2 פותחה ללימודי ביטוי גנים אורן loblolly,

Abstract

PtGen2 הוא cDNA microarray 26,496 תכונה המכיל מוגבר אורן ESTs loblolly. מערך מיוצר במעבדה שלנו לשימוש על ידי חוקרים לומד ביטוי גנים במינים כוניפאר אורן אחרים. PtGen2 פותחה בעקבות גילוי הגן שלנו מאמצים אורן loblolly, והוא מורכב רצפים מזוהים בעיקר לרקמות השורש, אלא גם מן המחט גזע. ^1,2 PtGen2 נבדק על ידי והכלאה שונים סיי-צבע שכותרתו cDNAs כוניפאר היעד , הן באמצעות מוגבר ולא מוגבר בשיטות תיוג עקיף, נבדק גם עם מספר תנאים הכלאה ושטיפת. וידאו זה מתמקד בטיפול ועיבוד של שקופיות לפני ואחרי הכלאה מראש, כמו גם לאחר הכלאה, בעזרת כמה שינויים הנהלים שפותחו בעבר. ^3,4 כמו כן, בצורת טקסט בלבד, הם הפרוטוקולים המשמשים הדור, תיוג ולנקות של cDNA של היעד, כמו גם מידע על תוכנה המשמשת לעיבוד נתונים במורד הזרם.

PtGen2 מודפס עם חיץ להדפיס קניינית המכילה ריכוזים גבוהים של מלח זה יכול להיות קשה להסיר לחלוטין. השקופיות נשטפים הראשון לפתרון SDS חמים לפני הכלאה מראש. לאחר הכלאה מראש, השקופיות נשטפים במרץ כמה שינויים של מים כדי להשלים את הסרת מלחים הנותרים. LifterSlips ™ מנקים אז וממוקמים על השקופיות ומסומן cDNA נטען בזהירות בדרך של פעולה נימי המספק להפצה גם של המדגם על פני השקופית על microarray, ומקטין את הסיכוי ההתאגדות בועה. הכלאה של מטרות למערך נעשית על 48 מעלות צלזיוס בתנאי לחות גבוהה. לאחר ההכלאה, בסדרה של שוטף רגיל נעשים על 53 מעלות צלזיוס בטמפרטורת החדר במשך פעמים המורחבת. עיבוד PtGen2 שקופיות באמצעות טכניקה זו מפחיתה מלח SDS-derived חפצים נראים לעתים קרובות כאשר מערך מעובד פחות קפדני. והכלאה מטרות הנגזרות מספר מקורות שונים כוניפאר RNA, פרוטוקול זה הניב ממצאים פחות עיבוד, רקע מופחת, ובלבד עקביות טוב יותר בין קבוצות הניסוי שונים של מערכים.

Protocol

(הערה סעיפים 1-4 לא הפגינו וידאו)

הכנת סיי שכותרתו יעד cDNA

להלן פרוטוקול אנו משתמשים לסינתזה cDNA של אורן loblolly RNA סך תיוג עקיף cDNA microarray לפני הכלאות. למרות כמה לא טריוויאלי שינויים נעשו, להלן פרוטוקול דומה לזה במדריך המסופק עם ערכת הדרכה עילי תיוג cDNA העקיפים של Invitrogen.

חלק 1: ראשון סטרנד סינתזה cDNA התגובה

1. מערבבים בקצרה ספין כל רכיב ערכת לפני השימוש.
2. הכן התגובות כדלקמן:
   • Xμl DEPC-H ₂ O
   • Xμl סך RNA, 20 מיקרוגרם / תגובה (pretreated עם DNase טורבו Ambion של)
   • 2μl אוליגו מעוגנת (DT) ₂₀ פריימר (2.5μg/μl)
   • 1μl Hexamer אקראיים פריימר
   • הנפח הכולל = 18μl
3. דגירה צינורות ב 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן מקום על הקרח במשך 1-2 דקות.
4. הוסף את הפרטים הבאים צינור כל תגובה על הקרח:
   • 6μl חיץ 5X סטרנד ראשון
   • 1.5μl 0.1M DTT
   • 1.5μl 10mm dNTP לערבב
   • 1μl RNaseOUT (40U/μl)
   • 2μl עילי III RT (400U/μl)
5. מערבבים בעדינות ספין בקצרה. דגירה צינור לילה בשעה 45 ° C.
6. הוסף 15μl של 1M NaOH אל צינור כל תגובה ומערבבים היטב.
7. דגירה צינור ב 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
8. הוסף 15μl של 1M HCl, לערבב בעדינות.
9. הוסף 20μl נתרן אצטט 3M (pH 5.2); לערבב בעדינות.

חלק 2: טיהור ראשון סטרנד cDNA.

1. הוסף 500μl של הצפת טוען את cDNA (מ שלב 1.9) ומערבבים היטב.
2. מניחים טיהור SNAP עמודה (המסופק עם ערכת תיוג עקיף) על צינור איסוף לטעון cDNA שלך על הטור.
3. ספין על g 14,000 בטמפרטורת החדר למשך דקה 1: לבטל את הזרימה דרך.
4. מניחים את טור SNAP על הצינור אוסף אותו ולהוסיף 500μl של הצפת לשטוף.
5. ספין על g 14,000 בטמפרטורת החדר למשך דקה 1: לבטל את הזרימה דרך.
6. חזור על שלבים 2.4 ו -2.5 שלוש פעמים, עבור סכום כולל של שלושה שוטף 500μl.
7. ספין עוד פעם אחת ב g 14,000 בטמפרטורת החדר למשך 1 דקה שניות; להשליך את הזרימה דרך.
8. מניחים את טור SNAP על צינור 1.5ml חדש.
9. הוסף 50μl DEPC מים חמים (50 מעלות צלזיוס) לעמודה SNAP ועמודה לדגור על טמפ 'החדר למשך דקה 1. Elute cDNA באמצעות ספין ב g 14,000 ב temp החדר למשך דקה 1.
10. חזור על שלב 2.9, באמצעות 100μl של מים חמים DEPC ואת הצינור 1.5ml זהה eluent.
11. הוסף 20μl של נתרן אצטט 3M (pH 5.2) כדי eluent ממדרגות 2.9 ו 2.10.
12. הוסף 3μl של גליקוגן (20mg/ml) אל הצינור ומערבבים.
13. הוסף 500μl של EtOH קרים כקרח 100%, לערבב היטב, דגירה הצינור במשך שעה 1 ב -80 ° C.
14. ספין התחתית g 14,000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. הסר בזהירות את supernatant.
15. הוסף 500μl של EtOH קרים כקרח 70% ו לסובב את הצינור ב g 14,000 ב 4 ° C למשך דקה 5. הסר בזהירות את supernatant.
16. אוויר יבש המדגם במשך 5 דקות, להבטיח כי כל EtOH מוסר.
17. לחמם את הצפת זיווגים 2X ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות מחדש להשעות את המדגם cDNA ב 5μl של הצפת חם זיווגים 2X.
18. מחממים את החיץ cDNA / Coupling על 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ו מערבולת היטב. ודא כי גלולה cDNA שלך מלא מחדש תלויה למאגר זיווגים 2X.

חלק 3: סימון צבע פלואורסצנטי

בעת הכנת התגובה, להיות זהיר כדי לצמצם את החשיפה של הפתרון לצבוע לאור. כמו כן, DMSO היא hygroscopic ו יספוג לחות מהאוויר, אשר יגיבו עם אסתר NHS של צבע ואת להפחית באופן משמעותי את יעילות התגובה צימוד. שמור את DMSO מסופק בערכה של הבקבוקון הכתיר בורג ענבר ב -20 ° C, ולתת בקבוקון החם לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה על מנת למנוע התעבות. השתמש רק DMSO מסופק עם הערכה זו.

1. פתח חפיסה אחת של סי-3-5 או סיי דיי ולהוסיף 75μl של DMSO ישירות בקבוקון צבע.
2. הוסף 5μl של פתרון DMSO / לצבוע את הצינור מתוך שלב 2.18.
3. מערבבים היטב את הצינור דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך שעה 1.
4. הוסף 20μl של נתרן אצטט 3M (pH 5.2) לפתרון cDNA לצבוע מצמידים.
5. הוסף 500μl של הצפת טוען לפתרון cDNA. מערבבים היטב על ידי vortexing.
6. מניחים טור SNAP על צינור איסוף ברורה לטעון את הפתרון / חיץ cDNA.
7. ספין על g 14,000 בטמפרטורת החדר למשך דקה 1: לבטל את הזרימה דרך.
8. מניחים את טור SNAP על אוסף אותוהצינור; להוסיף 500μl של הצפת לשטוף לעמודה.
9. ספין על g 14,000 בטמפרטורת החדר למשך דקה 1: לבטל את הזרימה דרך.
10. חזור על שלבים 3. 8-3.9 שלוש פעמים, עבור סכום כולל של שלושה שוטף 500μl.
11. ספין עוד פעם אחת ב g 14,000 בטמפרטורת החדר למשך דקה 1: לבטל את הזרימה דרך.
12. מניחים את טור SNAP על צינור ענבר אוסף חדש.
13. הוסף 65μl DEPC מים חמים (50 מעלות צלזיוס) לעמודה SNAP ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך דקה 1.
14. ספין על g 14,000 בטמפרטורת החדר למשך 1 דקה לאסוף את הזרימה דרך. זרימה דרך להכיל 60μl של מטוהרים שלך לצבוע מצמידים cDNA.

חלק 4: הערכת נוהל סימון.

1. התנהגות assay ספקטרופוטומטר להעריך כל תיוג סיי-cDNA. חשב את המספר הכולל של pmol של cDNA מסונתז: [OD ₂₆₀ x vol. x 10 x 37ng/μl ³ ng / pg] / 324.5 pg / pmol. חישוב pmol הכולל של שולבו סיי-Dye לתגובת כל תיוג: pmol Cy3 = [OD ₅₅₀ X vol.] / 0.15; pmol Cy5 = [OD ₆₅₀ X vol.] / 0.25. בשלב הבא, לחשב את היחס של נוקלאוטיד pmol / pmol צבע עבור כל תגובה. תגובות אופטימלית ליצור> 6000pmol של cDNA (לכל 60ul)> 200pmol של סיי-Dye (לכל 60ul), וכן יחס נוקלאוטיד / צבע כלומר <30.

חלק 5: החלק Pre-Wash

1. מערך PtGen2 מודפס בשקופיות קורנינג UltraGaps (אמינו silane מצופה) ו cDNAs הם UV-לחצות מקושר. כתמים הדפס גלויים לעין בשל תכולת מלח גבוהה של המאגר.
2. השתמש בעט קצה יהלום לסמן את השקופית על האזורים העליונים והתחתונים של אזור ההדפסה (אופציונלי).
3. לשים כ 250 מ"ל מראש לחמם 43 ° C 0.2% SDS פתרון להחליק לתוך צלחת לשטוף מיקרוסקופ (3 "x 4").
4. מגלשות מקום להיות טרום הכלאה במעמד שקופיות לצלול לתוך הפתרון SDS 15-20 פעמים מאוד במרץ כדי להסיר את מלחי על השקופיות.
5. בעזרת מלקחיים, להסיר בזהירות את השקופיות מן המדף והניחו אותם בצנצנת Coplin המכיל מאגר הכלאה טרום (SSC 5X, 0.1% SDS, BSA 1%), כי כבר מראש לחמם 43 ° C. לדגור על 43 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת לפחות.

חלק 6: טרום הכלאה

1. סט חמש מנות שקופיות כביסה, כל אחד מלא millipure DH ₂ O, ואף אחד צנצנת Coplin מלא מולקולרית כיתה isopropanol. מניחים את השקופיות במעמד שקופיות תהליך ברצף עד חמש מנות ידי טבילת 20 פעמים.
2. הסר שקופיות שתיים בכל פעם מן לשטוף את המים החמישי לטבול 5-6 פעמים במקום isopropanol ומיד בשקופיות לתוך microfuge את השקופית (benchtop Chipmate, 2 עמדות) לבין ספין 1 דקה לייבוש.
3. מגלשות נקי עם אוויר דחוס מסונן באמצעות מחסנית 0.22 מיקרומטר לסנן למקם אותם עם הברקוד כלפי מעלה לשכת פתרונות הגנום הכלאה.
4. LifterSlips נקי ™ עם אוויר מסונן ואת המיקום אותם בשקופיות עם פסים לבנים כלפי מטה. השתמש טיפ pipet צהוב בעדינות כדי ליישר את תלוש מרים בשקופית (כביסה LifterSlips ™ הראשון אתנול 70% הוא אופציונלי. גילינו שזה יהיה מיותר.)

חלק 7: הכלאה

צריך להתבצע באור כהה מדי או נמוך מדי.

1. עבור כל שקופית להיות הכלאה, לחשב את כמות סיי-5 ו סי-3 שכותרתו cDNA לתת 50-75pmol של יעד זה. שילוב אלה כמויות לתוך צינור אחד ויבש ייבוש ואקום עם הגדרת חום 37-45 ° C. הימנע ייבוש לחלוטין!
2. Resuspend בדיקות מיובשים חיץ הכלאה 60mL (עשה טריים יום) בקצרה מערבולת.
3. דגירה cDNAs resuspended במשך 5 דקות בתוך אמבטיה 95 מעלות צלזיוס ואז microfuge מהירה למשך 30 שניות.
4. טען את נפח כל בדיקה על ידי resuspended לאט pipetting בצומת ™ שקופיות LifterSlip בתחתית (קוד סוף בר) של השקופית. השקופית יהיה לטעון בדרך של פעולה נימי. (שמעדיפים פיפטה על לשקופית ולאחר מכן בעדינות את השכבה LifterSlip ™ זו היא שיטה ירייה אחת מאז אם אתה מקבל בועות אתה לא יכול להזיז את ™ LifterSlip לאחר השמה אשר יכול להוביל למקום חפצי מריחות)
5. 20uL המקום DTT 100mm לתוך לחות בכל ממוקם היטב בקצוות של החדר.
6. הנח את הדף על החדר ולהדק את הברגים פקה. מכסים את החדר עם רדיד אלומיניום לטבול לתוך אמבטיה 48 מעלות צלזיוס במשך 12-18 שעות במים עם תסיסה עדינה בסל"ד 50-60.

חלק 8: פוסט הכלאה רוחצת

שוטף כל צריך להתבצע באור כהה מדי או נמוך מדי. שקופיות לא צריך להתייבש עד לשלב הסופי.

1. הגדר את אחד צנצנת Coplin פתרון מלא שטפי # 1 @ 53 ° C, ו - ארבע מנות שקופיות כביסה מלא 250 מ"ל של כל אחד מן הבאים: 1) Wאפר פתרון # 1 @ 53 ° C, 2) פתרון לשטוף # 2 @ בטמפרטורת החדר, 3 & 4) שתי מנות המכיל פתרון לשטוף # 3 @ בטמפרטורת החדר.
2. מוציאים בזהירות את השקופיות מתאי הכלאה ולמקם אותם שניים בכל פעם לתוך הצנצנת Coplin. השאירו למשך 30 שניות, ואז להרים את השקופית החוצה לאט את הפתק המתאמן יישאר בצנצנת. המקום שקופיות במעמד שקופיות לטבול מיד פתרון לשטוף # 1 (1X SSC, 0.2% SDS, מחממים עד 43 מעלות צלזיוס). חזור על הפעולה עד שכל LifterSlips יוסרו כל השקופיות להישטף הם הפתרון לשטוף # 1 צלחת. לצלול מתלה למעלה ולמטה 10 פעמים במרץ.
3. צלחת מקום 53 מעלות צלזיוס באוויר שייקר עם רועד בסל"ד 50-100 במשך 10 דקות.
4. העברת מתלה לשטוף פתרון # 2 (0.1X SSC, 0.2% SDS), לצלול 10 פעמים, דגירה בטמפרטורת החדר, רועד איטי במשך 10 דקות.
5. מתלה טובלים 15 פעמים לתוך הפתרון ליטול ידיים # 3 (0.1X SSC) כדי להסיר כל SDS השיורית לשאת מעל מ הפתרון לשטוף # 2. מתלה מקום הפתרון לשטוף second # 3 צלחת, לצלול 10 פעמים, ולאחר מכן להאט רועד במשך 10 דקות.
6. מגלשות מקום 50 מ"ל צינורות פלקון כתרים @ ספין 1,500 סל"ד בצנטריפוגה מצויד הרוטור דלי מתנדנד. הסר שקופיות אור מיכל proofed, אנו משתמשים בצינור אחר פלקון מכוסה בנייר אלומיניום, טיהור האוויר מהצינור עם גז חנקן, מכסה הדוק (זה מפחית חמצון של צבעים סי, סי-5 במיוחד בקיץ, כאשר רמות האוזון הוא הגבוה ביותר ). שקופיות יכול להיות מאוחסן במשך מספר שעות לפני הסריקה צינורות חנקן מטוהר, אולם התוצאות האות הטוב ביותר מתקבלים כאשר הסריקה נעשית מיד לאחר הכביסה.

חלק 9: איסוף נתונים וניתוח סטטיסטי

1. נתוני סריקה תמונה נאסף על ScanArray PerkinElmer. אנו משתמשים בהגדרה לסרוק 10 מיקרון ואיזון Cy3 ו Cy5 אותות בשיטת התאמת קו לפי הוראות היצרן.
2. קבצי TIF הם gridded ונתונים אות גלם שנאספו מסונן עם ImaGene גרסה 7.5 (, BioDiscovery Inc, אל סגונדו, קליפורניה)
3. הנתונים ונורמליזציה והערכה לקבוע סטטיסטית מינים הביע דיפרנציאלי תקף נעשה עם BRB מערך כלים Ver. 3.7.
4. ניתוח תבנית כדי להקל על קביעת גנים הביע מתואמת מתבצעת עם תוכנה Gene Expression ניתוח תבנית (GEPAS) Ver. 3.1.

באיור 1. דוגמה מערך PtGen2 מעובד באמצעות יב protoco

איור 2. דוגמה מערך PtGen2 מעובד באמצעות הכלאה רגילה ופרוטוקולים כביסה.

Discussion

PtGen2 היא פיתחה לאחרונה, cDNA microarray מותאם אישית נועד לשמש בעיקר על ידי הקהילה אורן loblolly מחקר. תוצאות ראשוניות שנוצר עד כה הראו את מערך להיות כלי חשוב בהערכת תעתיק אירועים המתרחשים בתגובה ללחץ בצורת, כמו גם ניטור השינויים המתרחשים במהלך התפתחות העובר בתוך הימי אורן, Pinus pinaster ^5,6 לנו גם הוכיחו לאחרונה כי PtGen2 עובד היטב הכלאות זנים לחצות באמצעות דגימות שבודדו היעד מגוון רחב של סוגים כוניפאר. ⁵ כפי PtGen2 הופך להיות מנוצל יותר על ידי חוקרים לומד ביטוי גנים Pinus ומינים אחרים כוניפאר, זה וידאו הכשרה צריך לספק להם את הדרוש בסיס טכני להפיק נתונים איכותיים לשחזור. בידינו, PtGen2 הניב תוצאות טובות כאשר מעובד על ידי הכלאה מחמירים יותר מאשר פרוטוקולים כביסה המועסקים בדרך כלל בעבודה microarray. גישות אחרות לעיבוד מערך PtGen2 היה מוצלח אבל היה חסר עקביות. בעקבות הצעדים הטכניים המתוארים כאן יעזרו להגדיל עקביות, במיוחד כאשר עיבוד כמויות גדולות של מערכים, ואת גם יעזור לצמצם במידה ניכרת ולחסל חפצים לא רצויים ורקעים גבוהה.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Pre-hybridization Buffer	Buffer			5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA
Hybridization Buffer	Buffer			30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS
Wash Solution #1	Buffer			1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C
Wash Solution #2	Buffer			0.1X SSC, 0.2% SDS
Wash Solution #3	Buffer			0.1X SSC
Isopropyl Alcohol	Reagent	Sigma-Aldrich	34959-2.5L
50mL Conical Tubes	Other	Falcon BD	352070
15mL Conical Tubes	Other	Falcon BD	352196	Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation
Coplin Jar		Wheaton	900520
Staining Dish & Rack	Other	Wheaton	900200
Albumin from bovine serum (BSA)	Other	Sigma-Aldrich	A-9418
PolyA RNA		Invitrogen	POLYA.GF
SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling	Kit	Invitrogen	L1014-02
Turbo DNase	Kit	Ambion	AM1907
System
Cy-5 Dye	Reagent	GE Healthcare	PA25001
Cy-3 Dye	Reagent	GE Healthcare	PA23001
LifterSlips™	Other	Erie Scientific	25X601
HybChambers	Equipment	GeneMachines	JHYB200003