Biology

प्रसंस्करण विनोदी पाइन PtGen2 सीडीएनए माइक्रोएरे

Published: March 20, 2009 doi: 10.3791/1182

W. Walter Lorenz¹, Yuan-Sheng Yu¹, Marta Simões², Jeffrey F. D. Dean¹

¹Warnell School of Forestry and Natural Resources, University of Georgia (UGA), ²Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica, Instituto Tecnologia Química e Biológica UNL, Av. da República

Summary

सीडीएनए माइक्रोएरे PtGen2 जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए विनोदी पाइन में विकसित किया गया था,

Protocol

(नोट 1 अनुभाग में 4 - वीडियो प्रदर्शन नहीं)

सीडीएनए Cy - लेबल लक्ष्य की तैयारी

इसके बाद हम विनोदी पाइन कुल शाही सेना और अप्रत्यक्ष सीडीएनए लेबलिंग से सीडीएनए संश्लेषण के लिए पहले का उपयोग करने के लिए hybridizations माइक्रोएरे प्रोटोकॉल है. हालांकि कुछ गैर तुच्छ संशोधनों बनाया गया है, नीचे प्रोटोकॉल अनुदेश Invitrogen सुपरस्क्रिप्ट अप्रत्यक्ष सीडीएनए लेबल किट के साथ प्रदान की पुस्तिका में समान है.

भाग 1: पहले Strand सीडीएनए संश्लेषण रिएक्शन

मिश्रण और संक्षेप में उपयोग करने से पहले प्रत्येक किट घटक स्पिन.
प्रतिक्रियाओं की तैयारी के रूप में इस प्रकार है:
- Xμl DEPC एच ₂ हे
- Xμl कुल शाही सेना, 20 μg / प्रतिक्रिया (Ambion टर्बो DNase साथ pretreated)
- 2μl लंगर oligo (डीटी) ₂₀ प्राइमर (2.5μg/μl)
- 1μl रैंडम hexamer प्राइमर
- कुल मात्रा = 18μl
70 ° 1-2 मिनट के लिए 5 मिनट के लिए सी, और फिर बर्फ पर जगह ट्यूबों सेते हैं.
प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए बर्फ पर निम्नलिखित जोड़ें:
- 6μl 5X प्रथम Strand बफर
- 1.5μl 0.1M डीटीटी
- 1.5μl 10mm dNTP मिश्रण
- 1μl RNaseOUT (40U/μl)
- 2μl सुपरस्क्रिप्ट III आरटी (400U/μl)
धीरे मिक्स और संक्षेप में स्पिन. ट्यूब 45 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस
प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए 1M NaOH के 15μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.
70 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ट्यूब को सेते हैं.
1M एचसीएल के 15μl जोड़ें, धीरे मिश्रण.
20μl 3M सोडियम एसीटेट (5.2 पीएच) में जोड़ें, धीरे मिश्रण.

भाग 2: सीडीएनए शुद्ध Strand पहले.

सीडीएनए (1.9 चरण) के लिए बफर लोड हो रहा है के 500μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.
एक संग्रह ट्यूब पर एक तस्वीर शोधन स्तंभ (अप्रत्यक्ष लेबल किट के साथ आपूर्ति) प्लेस और स्तंभ पर अपने सीडीएनए लोड.
1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 14,000 जी पर स्पिन, प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
उसी संग्रह ट्यूब पर स्नैप स्तंभ प्लेस और धो बफर के 500μl जोड़ें.
1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 14,000 जी पर स्पिन, प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
2.4 चरण और 25 तीन बार, तीन 500μl washes के एक कुल के लिए दोहराएँ.
14,000 जी पर 1 मिनट सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर एक बार और स्पिन, प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
एक नया 1.5ml ट्यूब पर स्नैप स्तंभ रखें.
तस्वीर कॉलम और 1 मिनट के लिए कमरे Temp पर सेते स्तंभ के लिए गर्म पानी DEPC (50 डिग्री सेल्सियस) के 50μl जोड़ें. 1 मिनट के लिए कमरे Temp पर 14,000 जी पर एक स्पिन के माध्यम से सीडीएनए Elute.
2.9 चरण दोहराएँ, गर्म DEPC पानी के 100μl और eluent के लिए एक ही 1.5ml ट्यूब का उपयोग कर.
चरणों 2.9 और 2.10 से eluent 3M सोडियम एसीटेट के 20μl (5.2 पीएच) जोड़ें.
ट्यूब और मिश्रण करने के लिए ग्लाइकोजन (20mg/ml) के 3μl जोड़ें.
ठंडा 100% EtOH के 500μl जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से, और 1 घंटे के लिए -80 पर ट्यूब सेते डिग्री सेल्सियस
14,000 जी में 4 पर ट्यूब ° C 20 मिनट के लिए स्पिन. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटायें.
ठंडा 70% EtOH के 500μl जोड़ें और 14,000 जी में 4 बजे ट्यूब स्पिन ° 5 मिनट के लिए सी. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटायें.
5 मिनट के लिए नमूना एयर शुष्क, सुनिश्चित करें कि सभी EtOH निकाल दिया जाता है.
37 में 2X युग्मन बफर गर्म ° 5 मिनट के लिए सी और गर्म 2X युग्मन बफर 5μl में सीडीएनए नमूना फिर से निलंबित.
50 सीडीएनए / युग्मन बफर हीट ° सी के लिए 10 मिनट और भंवर में अच्छी तरह से. सुनिश्चित करें कि आपके सीडीएनए गोली पूरी तरह 2X युग्मन बफर में फिर से निलंबित कर दिया.

भाग 3: प्रतिदीप्त डाई के साथ लेबल

जब प्रतिक्रिया की तैयारी, डाई समाधान के प्रकाश में जोखिम को कम करने के लिए सावधान रहना. इसके अलावा, DMSO हीड्रोस्कोपिक है और हवा है, जो डाई के एनएचएस एस्टर के साथ प्रतिक्रिया और काफी युग्मन प्रतिक्रिया क्षमता को कम से नमी को अवशोषित करेंगे. -20 ° सी में एक एम्बर पेंच छाया शीशी में किट में आपूर्ति DMSO रखें, और शीशी संक्षेपण को रोकने खोलने से पहले कमरे के तापमान पर गर्म . केवल इस किट के साथ प्रदान DMSO का उपयोग करें.

Cy-3 या Cy-5 डाई का एक पैकेट खोलें और DMSO के 75μl डाई शीशी को सीधे जोड़ने.
2.18 कदम से ट्यूब DMSO / डाई समाधान के 5μl जोड़ें.
अच्छी तरह से मिलाएं और 1 घंटे के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर ट्यूब को सेते हैं.
डाई से मिलकर सीडीएनए समाधान के लिए 3M सोडियम एसीटेट के 20μl (5.2 पीएच) जोड़ें.
सीडीएनए समाधान के लिए बफर लोड हो रहा है की 500μl जोड़ें. Vortexing द्वारा अच्छी तरह मिक्स.
एक स्पष्ट संग्रह ट्यूब पर एक तस्वीर स्तंभ प्लेस और सीडीएनए / बफर समाधान लोड.
1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 14,000 जी पर स्पिन, प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
एक ही संग्रह पर स्नैप स्तंभ प्लेसट्यूब, कॉलम को धो बफर के 500μl जोड़ने.
1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 14,000 जी पर स्पिन, प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
दोहराएँ कदम 3. 8-3.9 तीन बार, तीन 500μl washes के एक कुल के लिए.
14,000 जी पर 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक बार और स्पिन, प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
एक नई एम्बर संग्रह ट्यूब पर स्नैप स्तंभ रखें.
तस्वीर कॉलम और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते गर्म पानी DEPC (50 डिग्री सेल्सियस) के 65μl जोड़ें.
1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 14,000 जी पर घुमाओ और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा. प्रवाह के माध्यम से अपने डाई मिलकर सीडीएनए शुद्ध 60μl शामिल करना चाहिए.

भाग 4: नामांकन प्रक्रिया का आकलन.

स्पेक्ट्रोफोटोमीटर परख आचरण करने के लिए प्रत्येक Cy - सीडीएनए लेबलिंग का आकलन है. संश्लेषित सीडीएनए के pmol की कुल संख्या की गणना: [आयुध _डिपो 260 x Vol . 37ng/μl x x ³ 10 एनजी / स्नातकोत्तर / 324.5] pmol / स्नातकोत्तर. प्रत्येक लेबलिंग प्रतिक्रिया के लिए शामिल Cy - डाई की कुल pmol गणना: pmol Cy3 = [आयुध डिपो ₅₅₀ एक्स Vol.] / 0.15; Cy5 pmol = [आयुध डिपो ₆₅₀ एक्स खंड.] / .25. अगला, प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए pmol / nucleotide pmol डाई अनुपात की गणना. इष्टतम प्रतिक्रियाओं> 6000pmol उत्पन्न सीडीएनए (प्रति 60ul)> Cy - डाई के 200pmol (60ul प्रति), और एक nucleotide / डाई अनुपात है कि <30.

भाग 5: प्री - धो स्लाइड

PtGen2 ऐरे Corning UltraGaps स्लाइड्स (अमीनो - silane लेपित) पर छपा हुआ है और cDNAs यूवी - पार जुड़ा हुआ है. प्रिंट स्पॉट बफर के उच्च नमक सामग्री के लिए कारण स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं.
एक हीरे की टिप पेन का उपयोग करने के लिए मुद्रण क्षेत्र (वैकल्पिक) के ऊपरी और निचले क्षेत्रों के लिए स्लाइड चिह्न.
रखो लगभग 250ml 43 पूर्व गरम डिग्री सेल्सियस खुर्दबीन स्लाइड धोने पकवान (3 "x 4") में 0.2% एसडीएस समाधान.
प्लेस स्लाइड्स स्लाइड और एसडीएस 15-20 बार बहुत सख्ती समाधान के लिए स्लाइड्स पर लवण हटाने में डुबकी रैक में पूर्व संकरित.
संदंश का प्रयोग, ध्यान से रैक से स्लाइड्स हटाने और उन्हें एक Coplin पूर्व संकरण बफर (एसएससी 5X, 0.1% एसडीएस, 1% BSA) से युक्त जार किया गया है कि 43 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गरम में जगह कम से कम एक घंटे के लिए 43 ° सी में सेते हैं.

भाग 6: पूर्व संकरण

पाँच स्लाइड धोने बर्तन, प्रत्येक millipure DH ₂ हे के साथ भरा है, और एक Coplin आणविक ग्रेड isopropanol के साथ भरा जार सेट . एक स्लाइड रैक में स्लाइड्स प्लेस और पाँच व्यंजन के माध्यम से क्रमिक रूप से 20 बार प्रत्येक dunking प्रक्रिया.
निकालें पांचवें पानी और स्लाइड्स में स्लाइड microfuge (Chipmate benchtop, 2 पदों) में isopropanol और तुरंत जगह में डुबकी 5-6 बार धो से एक समय में दो स्लाइड्स और स्पिन 1 मिनट के लिए सूखी.
संपीड़ित हवा के साथ साफ़ स्लाइड 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर कारतूस के माध्यम से फ़िल्टर्ड है और उन्हें बार कोड एक जीनोमिक समाधान संकरण चैंबर में का सामना करना पड़ के साथ जगह है.
स्वच्छ LifterSlips ™ फ़िल्टर्ड हवा और उन्हें सफेद नीचे का सामना करना पड़ रहा स्ट्रिप्स के साथ स्लाइड्स पर स्थिति के साथ. एक पीला pipet टिप का उपयोग करने के लिए धीरे चोर पर्ची स्लाइड पर संरेखित (LifterSlips 70% इथेनॉल में ™ पहली धुलाई वैकल्पिक है हम यह अनावश्यक हो पाया है.)

भाग 7: संकरण

अंधेरे या कम प्रकाश में किया जाना चाहिए.

प्रत्येक स्लाइड संकरित हो के लिए, Cy-5 की राशि की गणना और Cy-3 प्रत्येक लक्ष्य का 50 - 75pmol दे सीडीएनए लेबल. एक एकल ट्यूब में उन मात्रा का मिश्रण है और 37-45 पर गर्मी की स्थापना के साथ एक निर्वात desiccator में सूखे डिग्री सेल्सियस पूरी तरह से सुखाने से बचें!
60ml संकरण बफर में सूखे जांच (ताजा उस दिन बना) और भंवर संक्षिप्त Resuspend.
एक 95 डिग्री सेल्सियस और फिर 30 सेकंड के लिए त्वरित microfuge स्नान में 5 मिनट के लिए resuspended cDNAs सेते हैं.
धीरे स्लाइड LifterSlip नीचे ™ (बार कोड अंत) स्लाइड के जंक्शन पर pipetting द्वारा पूरे resuspended जांच मात्रा लोड. स्लाइड केशिका कार्रवाई के माध्यम से लोड होगा. (कुछ स्लाइड पर विंदुक और फिर धीरे LifterSlip उपरिशायी ™ इस एक शॉट तरीका है क्योंकि अगर आप बुलबुले मिलता है आप नियुक्ति के बाद नेतृत्व कर सकते हैं जो smearing कलाकृतियों जगह LifterSlip ™ नहीं ले जा सकते हैं पसंद करते हैं)
प्लेस 20uL 100mm डीटीटी प्रत्येक नमी में अच्छी तरह से चैम्बर के सिरों पर स्थित है.
चैम्बर शीर्ष पर प्लेस और सांचा शिकंजा कस. चैम्बर एल्यूमीनियम और कोमल आंदोलन के साथ 12-18 घंटे के लिए 50-60 rpm पर 48 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में विसर्जित कर पन्नी के साथ कवर.

भाग 8: पोस्ट - संकरण Washes

सभी washes के अंधेरे या कम प्रकाश में बाहर किया जाना चाहिए. स्लाइड्स के अंतिम चरण तक सूखी कभी नहीं दी जानी चाहिए.

डब्ल्यू: 1) एक Coplin धो समाधान # 1 @ 53 डिग्री सेल्सियस, और चार स्लाइड धोने भरा 250ml निम्न में से प्रत्येक के साथ व्यंजन के साथ भरा जार सेटराख समाधान # 1 53 @ ° C 2,) समाधान धो # 2 @ कमरे के तापमान, 3 और 4) दो धो # 3 @ कमरे के तापमान समाधान युक्त व्यंजन.
ध्यान से संकरण कक्षों से स्लाइड्स हटाने और Coplin जार में एक समय पर उन्हें दो जगह. 30 सेकंड के लिए छोड़ दें, तो स्लाइड से बाहर उठा और धीरे धीरे चोर पर्ची जार में रहेगा. स्लाइड रैक और तुरंत धो समाधान # 1 (1X एसएससी, एसडीएस 0.2%, पहले से गरम करने के लिए 43 डिग्री सेल्सियस) में विसर्जित में रखें स्लाइड. दोहराएँ जब तक सभी LifterSlips को हटा रहे हैं और सभी स्लाइड्स के लिए धोया जा धो समाधान # 1 पकवान में हैं. रैक डुबकी ऊपर और नीचे सख्ती से 10 बार.
53 में प्लेस पकवान ° सी 10 मिनट के लिए 50-100 rpm पर झटकों के साथ हवा हिलनेवाला में.
कमरे के तापमान पर # 2 (0.1X एसएससी, 0.2% एसडीएस) समाधान, 10 बार डुबकी, और सेते धो रैक स्थानांतरण, धीमी गति से 10 मिनट के लिए मिलाते हुए.
डुबकी रैक पहली धो समाधान # 3 (0.1X एसएससी) में 15 बार हटाने के लिए किसी भी अवशिष्ट एसडीएस धो समाधान # 2 से ले. दूसरी धो समाधान में प्लेस रैक # 3 पकवान, डुबकी 10 बार, और फिर 10 मिनट के लिए मिलाते हुए धीमी गति से.
50ml फाल्कन छाया अपकेंद्रित्र और ट्यूबों स्पिन @ 1500 rpm में रखें स्लाइड्स झूल बाल्टी रोटर के साथ सुसज्जित है. स्लाइड्स हटाने के लिए proofed कंटेनर प्रकाश, हम एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर एक और फाल्कन ट्यूब, और ट्यूब से नाइट्रोजन गैस के साथ शुद्ध हवा, टोपी कस का उपयोग करें (इस गर्मी में Cy रंजक, विशेष रूप से Cy 5-के ऑक्सीकरण कम कर देता है जब ओजोन स्तर उच्चतम कर रहे हैं ). स्लाइड्स नाइट्रोजन purged ट्यूबों में स्कैनिंग करने से पहले कुछ घंटों के लिए भंडारित किया जा सकता है, तथापि, सबसे अच्छा संकेत परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जब स्कैनिंग धोने के तुरंत बाद किया जाता है.

भाग 9: डेटा संग्रह और सांख्यिकीय विश्लेषण

स्कैन छवि डेटा PerkinElmer ScanArray पर एकत्र किया जाता है. हम एक 10 माइक्रोन स्कैन की स्थापना और Cy3 संतुलन और Cy5 संकेतों निर्माता के निर्देशों के अनुसार लाइन समायोजन विधि का उपयोग का उपयोग करें.
TIF फाइलें gridded कर रहे हैं और कच्चे संकेत डेटा एकत्र और ImaGene संस्करण 7.5 (BioDiscovery, Inc, एल Segundo, सीए) के साथ फ़िल्टर
डेटा सामान्य और मूल्यांकन के लिए सांख्यिकीय मान्य विभिन्न व्यक्त प्रजातियों निर्धारित BRB ऐरे उपकरण वर के साथ किया जाता है. 3.7.
पैटर्न के लिए coordinately व्यक्त जीनों के दृढ़ संकल्प की सुविधा विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति पैटर्न विश्लेषण (GEPAS) सॉफ्टवेयर वर के साथ किया जाता है. 3.1.

चित्रा 1

चित्रा 1 PtGen2 संसाधित सरणी का उपयोग कर इस protoco एल के उदाहरण.

चित्रा 2

चित्रा 2 PtGen2 मानक संकरण और धोने प्रोटोकॉल का उपयोग संसाधित सरणी के उदाहरण .

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Discussion

PtGen2 एक हाल ही में विकसित की है, कस्टम सीडीएनए माइक्रोएरे है कि मुख्य रूप से विनोदी पाइन अनुसंधान समुदाय द्वारा इस्तेमाल किया जा डिजाइन किया गया था है. प्रारंभिक उत्पन्न परिणाम इस प्रकार दूर सरणी से पता चला है transcriptional घटनाओं है कि सूखे तनाव के जवाब में होते हैं, के रूप में अच्छी तरह से निगरानी परिवर्तन है कि समुद्री ^{पाइन,} Pinus सनोबर 5,6 हम में भ्रूण विकास के दौरान होते में के मूल्यांकन में एक महत्वपूर्ण उपकरण भी हाल ही दिखा दिया कि पार प्रजातियों लक्ष्य शंकुवृक्ष पीढ़ी की एक विविध रेंज से अलग नमूने का उपयोग कर hybridizations में अच्छी तरह से काम करता ^है PtGen2. 5 PtGen2 के रूप में अधिक Pinus और अन्य शंकुवृक्ष प्रजातियों में जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग हो जाता है, इस प्रशिक्षण वीडियो उन्हें आवश्यक के साथ प्रदान करना चाहिए तकनीकी नींव गुणवत्ता और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा उत्पन्न करने के लिए. हमारे हाथ में, PtGen2 बेहतर परिणाम सामने आए जब और अधिक कठोर और आम तौर पर माइक्रोएरे काम में कार्यरत उन लोगों की तुलना में संकरण धोने प्रोटोकॉल द्वारा संसाधित. PtGen2 सरणी प्रसंस्करण के लिए अन्य तरीकों सफल रहा है, लेकिन निरंतरता का अभाव है. तकनीकी यहाँ वर्णित चरणों के बाद स्थिरता बढ़ाने में मदद, खासकर जब arrays के बड़ी संख्या प्रसंस्करण होगा, और भी बहुत कम है और अवांछित कलाकृतियों और उच्च पृष्ठभूमि को खत्म करने में मदद करेगा.

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Acknowledgments

लेबलिंग, संकरण, और धोने प्रोटोकॉल के साथ साथ जबकि जीनोमिक अनुसंधान (अधिक पढ़ें), Vanderbilt माइक्रोएरे साझा संसाधन (VMSR) में डा. शॉन लेवी के लिए संस्थान में डॉ. जे Quackenbush द्वारा पहले विकसित उन लोगों के लिए कुछ संशोधनों के, और डा. होते रोब अल्बा जबकि Boyce थॉम्पसन संस्थान (BTI) कार्नेल विश्वविद्यालय में.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Pre-hybridization Buffer	Buffer			5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA
Hybridization Buffer	Buffer			30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS
Wash Solution #1	Buffer			1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C
Wash Solution #2	Buffer			0.1X SSC, 0.2% SDS
Wash Solution #3	Buffer			0.1X SSC
Isopropyl Alcohol	Reagent	Sigma-Aldrich	34959-2.5L
50mL Conical Tubes	Other	Falcon BD	352070
15mL Conical Tubes	Other	Falcon BD	352196	Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation
Coplin Jar		Wheaton	900520
Staining Dish & Rack	Other	Wheaton	900200
Albumin from bovine serum (BSA)	Other	Sigma-Aldrich	A-9418
PolyA RNA		Invitrogen	POLYA.GF
SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling	Kit	Invitrogen	L1014-02
Turbo DNase	Kit	Ambion	AM1907
System
Cy-5 Dye	Reagent	GE Healthcare	PA25001
Cy-3 Dye	Reagent	GE Healthcare	PA23001
LifterSlips™	Other	Erie Scientific	25X601
HybChambers	Equipment	GeneMachines	JHYB200003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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