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Biology

Procesamiento de los Pinus taeda PtGen2 cDNA microarray

Published: March 20, 2009 doi: 10.3791/1182
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Warnell School of Forestry and Natural Resources, University of Georgia (UGA), 2Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica, Instituto Tecnologia Química e Biológica UNL, Av. da República

Summary

El cDNA microarrays PtGen2 fue desarrollado para estudios de expresión génica en el pino de incienso,

Abstract

PtGen2 es un microarray de cDNA que contiene 26.496 función amplificada EST pino taeda. La serie es producida en nuestro laboratorio para su uso por los investigadores que estudian la expresión de genes en las especies de coníferas de pino y otros. PtGen2 se desarrolló como resultado de nuestros esfuerzos de descubrimiento de genes de pino de incienso, y se compone de secuencias identificadas principalmente de tejidos de la raíz, sino también de la aguja y el tallo. 1,2 PtGen2 ha sido probado por hibridación de diferentes tintes de Cy-etiquetados ADNc objetivo de coníferas , utilizando tanto amplificada y no amplificada, los métodos indirectos de etiquetado, y también probó con una serie de condiciones de hibridación y lavado. Este vídeo se centra en la manipulación y elaboración de las diapositivas antes y después de pre-hibridación, así como después de la hibridación, con algunas modificaciones a los procedimientos desarrollados con anterioridad. 3,4 También se incluyen, en forma de texto único, son los protocolos que se utilizan para la generación, el etiquetado y la limpieza de s objetivo cDNA, así como información sobre el software utilizado para el procesamiento de datos de salida.

PtGen2 se imprime con un búfer de impresión de propiedad que contiene altas concentraciones de sal que puede ser difícil de eliminar por completo. Las diapositivas se lavan por primera vez en una cálida solución de SDS antes de la pre-hibridación. Después de pre-hibridación, las diapositivas se lavan con fuerza en varios cambios de agua para completar la eliminación de las sales restantes. LifterSlips ™ que se han limpiado y colocado en las diapositivas y etiquetados cDNA se carga en el cuidado de microarrays mediante una acción capilar que proporciona una distribución uniforme de la muestra a través de la diapositiva, y reduce la posibilidad de la incorporación de la burbuja. La hibridación de los objetivos de la matriz se realiza a 48 ° C en condiciones de alta humedad. Después de la hibridación, una serie de lavados estándar se realiza a 53 ° C y temperatura ambiente durante períodos prolongados. Procesamiento PtGen2 diapositivas utilizando esta técnica reduce la sal y la SDS-derivados artefactos a menudo se ve cuando la matriz se procesa con menos rigor. Hibridación de los objetivos derivados de varias fuentes diferentes de coníferas de ARN, el procesamiento del protocolo dado menos artefactos de fondo reducido, y proporcionan una mayor coherencia entre los diferentes grupos experimentales de arrays.

Protocol

(Tenga en cuenta las secciones 1 - 4 No demostrada en Video)

Preparación de Cy-etiquetados objetivo cDNA

Lo que sigue es el protocolo que utiliza para la síntesis de cDNA a partir de ARN total de pino taeda y el etiquetado de cDNA indirecta antes de microarrays hibridaciones. Aunque a algunos no triviales se han realizado modificaciones, el protocolo de abajo es similar a la del manual de instrucciones proporcionado con superíndice Kit indirectos de la Invitrogen Etiquetado cDNA.

Parte 1: primer capítulo de reacción de síntesis de cDNA

  1. Mezclar y brevemente giro cada componente del kit antes de su uso.
  2. Prepare las reacciones de la siguiente manera:
    • Xμl DEPC-H 2 O
    • Xμl ARN total, 20 mg / reacción (pretratamiento con DNasa Turbo de Ambion)
    • 2μl anclado oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl)
    • Primer 1μl azar hexamer
    • Volumen total = 18μl
  3. Incubar los tubos a 70 ° C durante 5 minutos, y luego colocar en hielo durante 1-2 minutos.
  4. Agregue lo siguiente a cada tubo de reacción sobre hielo:
    • 6μl 5X primer capítulo de buffer
    • 1.5μl 0,1 M TDT
    • 1.5μl 10 mM dNTP mix
    • 1μl RNaseOUT (40U/μl)
    • 2μl superíndice III RT (400U/μl)
  5. Mezclar suavemente y girar brevemente. Incubar el tubo en la noche a 45 ° C.
  6. Añadir 15μl de NaOH 1 M a cada tubo de reacción y mezclar bien.
  7. Incubar el tubo a 70 ° C durante 10 minutos.
  8. Añadir 15μl de HCl 1 M y mezcle suavemente.
  9. Añadir 20μl de acetato de sodio 3M (pH 5.2) y mezclar suavemente.

Parte 2: Purificación primer capítulo de cDNA.

  1. Agregar 500μl de tampón de carga a la cDNA (del Paso 1.9) y mezclar bien.
  2. Coloque una columna de purificación de SNAP (suministrado con el kit de marcaje indirecto) en un tubo de recogida y la carga de su cDNA en la columna.
  3. Giran a 14.000 g a temperatura ambiente durante 1 minuto, descartar el filtrado.
  4. Colocar la columna de cupones para alimentos en el tubo de la misma colección y añadir 500μl de tampón de lavado.
  5. Giran a 14.000 g a temperatura ambiente durante 1 minuto, descartar el filtrado.
  6. Repita los pasos 2,4 y 2,5 veces tres, para un total de tres lavados 500μl.
  7. Girar una vez más a 14.000 g a temperatura ambiente durante un minuto seg; deseche el flujo continuo.
  8. Colocar la columna de cupones para alimentos en un tubo de 1,5 ml nuevo.
  9. Añadir 50μl de agua caliente con DEPC (50 ° C) a la columna de cupones para alimentos y la columna se incuban a temperatura ambiente durante 1 minuto. Eluir el cDNA a través de un giro a 14.000 g a temperatura ambiente durante 1 minuto.
  10. Repita el paso 2.9, utilizando 100μl de agua tibia con DEPC agua y el mismo tubo 1,5 ml de eluyente.
  11. Añadir 20μl de acetato de sodio 3M (pH 5,2) para el eluyente de los pasos 2.9 y 2.10.
  12. Añadir 3μl de glucógeno (20mg/ml) en el tubo y mezclar.
  13. Agregar 500μl de helado de EtOH al 100%, mezclar bien e incubar el tubo durante 1 hora a -80 º C.
  14. Girar el tubo a 14.000 ga 4 ° C durante 20 minutos. Retire con cuidado el sobrenadante.
  15. Agregar 500μl de helado de EtOH 70% y el giro del tubo a 14.000 ga 4 ° C durante 5 minutos. Retire con cuidado el sobrenadante.
  16. Aire seco de la muestra durante 5 minutos; asegurar que todos los EtOH se retira.
  17. Caliente el tampón de acoplamiento 2X a 37 ° C durante 5 minutos y vuelva a suspender la muestra de ADNc en 5μl de búfer cálidos acoplamiento 2X.
  18. Calentar el cDNA / buffer de acoplamiento a 50 ° C durante 10 minutos y agitar bien. Asegúrese de que el cDNA pellet es totalmente re-suspendido en el tampón de acoplamiento 2X.

Parte 3: Etiquetado con tinte fluorescente

En la preparación de la reacción, tenga cuidado para minimizar la exposición de la solución de colorante a la luz. Además, el DMSO es higroscópico y absorbe la humedad del aire, que va a reaccionar con el éster de NHS del colorante y reducir significativamente la eficacia de la reacción de acoplamiento. Mantenga el DMSO suministrado en el kit en un tapón de rosca vial ámbar a -20 ° C, y dejar que el vial alcance la temperatura ambiente antes de abrir para evitar la condensación. Utilice sólo el DMSO suministrado con el kit.

  1. Abrir un paquete de Cy-3 o Cy-5 Dye y añadir 75μl de DMSO directamente al vial de tinte.
  2. Añadir 5μl de la solución de DMSO / colorante en el tubo de paso 2.18.
  3. Mezclar bien e incubar el tubo a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 hora.
  4. Añadir 20μl de acetato de sodio 3M (pH 5,2) a la solución de tinte junto cDNA.
  5. Agregar 500μl de tampón de carga a la solución de cDNA. Mezclar bien por agitación.
  6. Coloque una columna de SNAP en un tubo de recogida de claro y cargue la solución de cDNA / buffer.
  7. Giran a 14.000 g a temperatura ambiente durante 1 minuto, descartar el filtrado.
  8. Colocar la columna de cupones para alimentos en la misma coleccióntubo, añadir 500μl de tampón de lavado a la columna.
  9. Giran a 14.000 g a temperatura ambiente durante 1 minuto, descartar el filtrado.
  10. Repita los pasos 3. 8-3.9 tres veces, para un total de tres lavados 500μl.
  11. Girar una vez más a 14.000 g a temperatura ambiente durante 1 minuto, descartar el filtrado.
  12. Colocar la columna de cupones para alimentos en un tubo de la nueva colección de color ámbar.
  13. Añadir 65μl de agua caliente con DEPC (50 ° C) a la columna de SNAP e incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto.
  14. Giran a 14.000 g, a temperatura ambiente durante 1 minuto y recoger el filtrado. El flujo a través deberá contener 60μl de su purificada de tinte junto cDNA.

Parte 4: Evaluación del procedimiento de etiquetado.

  1. Llevar a cabo un ensayo para evaluar cada espectrofotómetro etiquetado Cy-cDNA. Calcular el número total de pmol de cDNA sintetizado: [DO 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg] / 324,5 pg / pmol. Calcular el total de pmol incorporado Cy-Dye para cada reacción de marcaje: pmol Cy3 = [OD 550 X vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [OD 650 X vol.] / 0,25. A continuación, calcular la pmol de nucleótidos / pmol relación de tinte para cada reacción. Reacciones óptimo generar 6000pmol> de cDNA (por 60ul),> 200pmol de Cy-Dye (por 60ul), y una relación de nucleótidos / tinte que es <30.

Parte 5: Diapositiva de prelavado

  1. La matriz PtGen2 está impreso en Corning diapositivas UltraGAPS (amino-silano recubiertos) y ADNc son UV-reticulado. Puntos de impresión son visibles debido a la alta salinidad del buffer.
  2. Utilice un rotulador de punta de diamante para marcar la diapositiva de las zonas superior e inferior del área de impresión (opcional).
  3. Ponga aproximadamente 250 ml previamente calentada a 43 ° C 0.2% de solución de SDS en la fuente de lavado del portaobjetos del microscopio (3 "x 4").
  4. Colocar los portaobjetos para ser pre-hibridación en el estante de diapositivas y sumergirse en la solución de SDS 15-20 veces con mucha energía para eliminar las sales en las diapositivas.
  5. Con unas pinzas, retirar con cuidado las diapositivas de la rejilla y colóquelos en un frasco de Coplin que contiene pre-hibridación Buffer (5X SSC, 0,1% SDS, 1% BSA) que ha sido previamente calentada a 43 ° C. Se incuba a 43 ° C durante por lo menos una hora.

Parte 6: Pre-hibridación

  1. Establecido cinco platos de lavado de diapositivas, cada una con millipure dH 2 O, y una jarra de Coplin llena de isopropanol grado molecular. Colocar los portaobjetos en una gradilla para portaobjetos y el proceso de forma secuencial a través de cinco platos a mojar 20 veces cada uno.
  2. Retirar los portaobjetos dos a la vez desde el agua de lavado quinto y baño 5-6 veces en el lugar de isopropanol y de inmediato en una presentación de diapositivas en la microcentrífuga (sobremesa Chipmate, 2 posiciones) y el giro de 1 minuto a secas.
  3. Diapositivas limpiar con aire comprimido filtrado a través de un cartucho de filtro de 0,22 M y el lugar con el código de barras hacia arriba en una cámara de hibridación Genomic Solutions.
  4. LifterSlips Clean ™ con aire filtrado y colocarlos en las diapositivas con las tiras blancas hacia abajo. Utilice una punta de pipeta amarilla para alinear con cuidado la hoja de levantador de la diapositiva (lavado LifterSlips ™ por primera vez en etanol al 70% es opcional. Hemos encontrado que es innecesario.)

Parte 7: La hibridación

Debe llevarse a cabo en la oscuridad o bajo luz baja.

  1. Para cada diapositiva que se hibridan, calcular la cantidad de Cy-5 y Cy-3 etiquetados cDNA para dar 50-75pmol de cada objetivo. Combine las cantidades en un solo tubo y seca en un secador de vacío con el ajuste de calor a 37-45 ° C. Evitar que se seque por completo!
  2. Resuspender las sondas de hibridación de amortiguación seca en 60 ml (recién hecho ese día) y agitar brevemente.
  3. Incubar los cDNAs resuspendido durante 5 minutos en un baño de 95 ° C y luego microfuga rápido durante 30 segundos.
  4. De carga de todo el volumen de la sonda se resuspendieron lentamente pipeteo en el slide-LifterSlip ™ unión en la parte inferior (código de barras) de la diapositiva. La diapositiva se carga por medio de la acción capilar. (Algunos prefieren la pipeta a la diapositiva y luego suavemente la superposición LifterSlip ™ es un método de un disparo ya que si te las burbujas no se puede mover el LifterSlip ™ después de la colocación que puede conducir a punto artefactos manchas)
  5. 20 ul lugar de la TDT en 100 mM de cada bien la humedad situados en los extremos de la cámara.
  6. Coloque la parte superior de la cámara y apretar los tornillos de la leva. Cubrir la cámara con papel de aluminio y sumergirse en un baño de agua 48 ° C durante 12-18 horas con agitación suave a 50-60 rpm.

Parte 8: La hibridación Post-Lava

Todos los lavados deben llevarse a cabo en la oscuridad o bajo luz baja. Las diapositivas no deben dejarse secar hasta que el último paso.

  1. Establecer una jarra de Coplin llena con solución de lavado # 1 @ 53 ° C, y cuatro platos de diapositivas de lavado llena con 250 ml de cada una de las siguientes: 1) Wcenizas Solución # 1 @ 53 ° C, 2) solución de lavado # 2 @ temperatura ambiente, 3 y 4) dos platos que contienen solución de lavado # 3 @ temperatura ambiente.
  2. Retire con cuidado las diapositivas de las cámaras de hibridación y el lugar de dos en dos un momento en el frasco de Coplin. Dejar durante 30 segundos, luego levante la diapositiva a cabo lentamente y el deslizamiento elevador se mantendrá en el frasco. Colocar los portaobjetos en la gradilla para portaobjetos e inmediatamente sumergirse en la solución de lavado # 1 (1X SSC, 0,2% SDS, el precalentamiento a 43 ° C). Repita hasta que todos se retiran y se LifterSlips todas las diapositivas que vaya a lavar en la solución de lavado # 1 plato. Sumérgete en rack arriba y hacia abajo 10 veces con fuerza.
  3. Plato a cabo en 53 ° C en el aire coctelera con agitación a 50 a 100 rpm durante 10 minutos.
  4. Transferencia de rejilla para la solución de lavado # 2 (0,1 X SSC, 0,2% SDS), caída de 10 veces, y se incuban a temperatura ambiente, agitando lento durante 10 minutos.
  5. Dip de rack de 15 veces en la primera solución de lavado # 3 (0.1X SSC) para eliminar cualquier residuo de SDS se transfieren de la solución de lavado # 2. Bastidor a cabo en la solución de lavado # 3 segundos platos, caída de 10 veces, y luego lenta agitación durante 10 minutos.
  6. Colocar los portaobjetos en 50 ml tubos Falcon tope y girar @ rpm 1.500 en centrífuga equipada con un rotor basculante. Retirar los portaobjetos a la luz de contenedores a prueba, se utiliza otro tubo Falcon cubierta con papel de aluminio y de purga de aire del tubo de gas nitrógeno, tapa bien (lo que reduce la oxidación de los tintes Cy, especialmente Cy-5 en el verano cuando los niveles de ozono son más altos ). Las diapositivas se pueden almacenar durante un par de horas antes de la digitalización en los tubos de nitrógeno purgado, sin embargo, mejores resultados se obtienen cuando la señal de escaneo se realiza inmediatamente después del lavado.

Parte 9: Recolección de datos y análisis estadístico

  1. Datos de escaneo de imagen se recoge en una ScanArray PerkinElmer. Nosotros usamos un valor de escaneo de 10 micras y el balance de Cy3 y Cy5 señales usando el método de ajuste de línea según las instrucciones del fabricante.
  2. TIF son cuadriculados y los datos brutos de la señal recogida y filtrada con Imagene versión 7.5 (biodescubrimiento, Inc., El Segundo, CA)
  3. La normalización de datos y evaluación para determinar estadísticamente especies válidas expresados ​​diferencialmente se hace con BRB matriz Ver herramientas. 3.7.
  4. Análisis de patrones para facilitar la determinación de los genes expresados ​​de forma coordinada se realiza con el software de análisis de patrones de expresión génica (GEPAS) Ver. 3.1.

Figura 1

Figura 1. Ejemplo de PtGen2 serie procesados ​​con este l. PROTOCOLO DE

Figura 2

Figura 2. Ejemplo de PtGen2 serie procesados ​​mediante hibridación estándar y protocolos de lavado.

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Discussion

PtGen2 es un recientemente desarrollado, los microarrays de cDNA a medida que fue diseñado para ser utilizado principalmente por la comunidad de investigación de pino taeda. Los resultados preliminares generados hasta el momento han demostrado la matriz para ser una herramienta valiosa en la evaluación de los acontecimientos de la transcripción que se producen en respuesta a estrés por sequía, así como en el seguimiento de los cambios que se producen durante el desarrollo del embrión en el pino marítimo, Pinus pinaster 5,6 Hemos También ha demostrado recientemente que PtGen2 funciona bien en las hibridaciones entre especies utilizando muestras objetivo aislado de una amplia gama de géneros de coníferas. PtGen2 5 Como se hace más utilizados por los investigadores que estudian la expresión génica en Pinus y otras especies de coníferas, este video de entrenamiento debe proporcionarles la necesaria técnicas para generar bases de datos de calidad y reproducible. En nuestras manos, PtGen2 dado mejores resultados cuando son procesadas por más de hibridación rigurosas y los protocolos de lavado de las que normalmente se emplean en el trabajo de microarrays. Otros enfoques de procesamiento de la matriz PtGen2 han tenido éxito, pero carecía de consistencia. Siguiendo los pasos técnicos descritos aquí le ayudará a aumentar la coherencia, en particular en el tratamiento de un gran número de matrices, y también ayudará a reducir en gran medida y eliminar objetos no deseados y los fondos de alto.

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Acknowledgments

El etiquetado, la hibridación y los protocolos de lavado de este documento contiene algunas modificaciones a los desarrollados anteriormente por el Dr. J. Quackenbush, mientras que en el Instituto de Investigación Genómica (TIGR), el Dr. Shawn Levy en la Vanderbilt microarray Shared Resource (VMSR), y el Dr. Rob Alba, mientras que en el Instituto Boyce Thompson (BTI), la Universidad de Cornell.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Pre-hybridization Buffer Buffer 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA
Hybridization Buffer Buffer 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS
Wash Solution #1 Buffer 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C
Wash Solution #2 Buffer 0.1X SSC, 0.2% SDS
Wash Solution #3 Buffer 0.1X SSC
Isopropyl Alcohol Reagent Sigma-Aldrich 34959-2.5L
50mL Conical Tubes Other Falcon BD 352070
15mL Conical Tubes Other Falcon BD 352196 Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation
Coplin Jar Wheaton 900520
Staining Dish & Rack Other Wheaton 900200
Albumin from bovine serum (BSA) Other Sigma-Aldrich A-9418
PolyA RNA Invitrogen POLYA.GF
SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling Kit Invitrogen L1014-02
Turbo DNase Kit Ambion AM1907
System
Cy-5 Dye Reagent GE Healthcare PA25001
Cy-3 Dye Reagent GE Healthcare PA23001
LifterSlips™ Other Erie Scientific 25X601
HybChambers Equipment GeneMachines JHYB200003

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References

  1. Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
  2. Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.
  3. Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
  4. Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).
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  6. Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. September 24-27, Albena, Bulgaria, , (2008).

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Biología Vegetal Número 25 Pinus taeda P. taeda cDNA microarrays el procesamiento de diapositivas
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