Summary
Den cDNA microarray PtGen2 har utvecklats för studier genuttryck i Loblolly tall,
Abstract
PtGen2 är en 26.496 funktion cDNA microarray innehåller förstärkta EST Loblolly furu. Matrisen är producerad i vårt laboratorium för att användas av forskare att studera genuttryck i furu och andra barrträd arter. PtGen2 utvecklades som ett resultat av våra ansträngningar genfynd i Loblolly furu och består av sekvenser identifieras främst från roten vävnader, men även från nål och stjälk. 1,2 PtGen2 har testats av hybridisering olika Cy-dye märkt barrträd mål cDNAs , med både förstärks och icke-förstärkta indirekta märkning metoder, och även testat med ett antal hybridisering och tvätt förhållanden. Denna video fokuserar på hantering och bearbetning av bilder före och efter pre-hybridisering, och efter hybridisering, med några ändringar av förfaranden som utvecklats tidigare. 3,4 ingår också, i textform bara är de protokoll som används för generering, märkning och sanering av mål cDNA s, samt information om programvara som används för nedströms databehandling.
PtGen2 är tryckt med en egen utskrift buffert som innehåller höga halter av salt som kan vara svåra att få bort helt. Bilderna tvättas först i en varm SDS lösning innan pre-hybridisering. Efter pre-hybridisering, är bilderna tvättas kraftigt i flera byten av vatten för att fullständigt avlägsnande av återstående salter. LifterSlips ™ är sedan rengörs och placeras på bilderna och märkt cDNA är noga lastas på microarray genom kapillärkraft som innebär jämn fördelning av urvalet över bilden, och minskar risken för bubblan bolagsordningen. Hybridisering av mål för att matrisen sker vid 48 ° C i hög luftfuktighet. Efter hybridisering, är en serie av standard tvättar sker vid 53 ° C och rumstemperatur under längre tider. Bearbetning PtGen2 bilder med denna teknik minskar salt och SDS-derived artefakter ofta när matrisen behandlas mindre strängt. Hybridisering med utgångspunkt från flera olika barrträd RNA källor, gav denna behandling protokoll färre artefakter, minskad bakgrund och givit bättre konsekvens mellan olika experimentella grupper av matriser.
Protocol
(Observera avsnitt 1 till 4 inte påvisats i Video)
Förbereda Cy-märkta Target cDNA
Vad som följer är det protokoll som vi använder för cDNA syntes från total Loblolly tall RNA och indirekta cDNA märkning före microarray hybridizations. Även ett fåtal icke-triviala ändringar har gjorts, men protokollet nedan liknande den i bruksanvisningen som följer med Invitrogen är Upphöjd Indirekt cDNA Märkning Kit.
Del 1: Första Strand cDNA syntes Reaktion
- Blanda och kortfattat snurra varje sats komponent före användning.
- Förbered reaktioner som följer:
- Xμl DEPC-H 2 O
- Xμl totala RNA, 20 mikrogram / reaktion (förbehandlats med Ambion Turbo DNas)
- 2μl Förankrad Oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl)
- 1μl Slump Hexamer Primer
- Total volym = 18μl
- Inkubera rören vid 70 ° C i 5 minuter, och sedan placera på is i 1-2 minuter.
- Lägg till följande i varje reaktionsrör på is:
- 6μl 5X Första Strand buffert
- 1.5μl 0,1 miljoner DTT
- 1.5μl 10 mM dNTP mix
- 1μl RNaseOUT (40U/μl)
- 2μl Upphöjd III RT (400U/μl)
- Blanda försiktigt och snurra kort. Inkubera röret över natten vid 45 ° C.
- Tillsätt 15μl 1 M NaOH till varje reaktion röret och blanda väl.
- Inkubera röret i 70 ° C i 10 minuter.
- Tillsätt 15μl 1 M HCl, blanda försiktigt.
- Lägg 20μl 3M natriumacetat (pH 5,2), blanda försiktigt.
Del 2: Purifying Första Strand cDNA.
- Tillsätt 500μl av buffert till cDNA (från steg 1,9) och blanda väl.
- Placera en kolumn SNAP Purification (medföljer Indirekt Märkning kit) på en samling rör och ladda ditt cDNA på kolumnen.
- Snurra på 14.000 gram i rumstemperatur i 1 minut, släng genomströmning.
- Placera SNAP kolumn på samma provröret och tillsätt 500μl tvättbuffert.
- Snurra på 14.000 gram i rumstemperatur i 1 minut, släng genomströmning.
- Upprepa steg 2,4 och 2,5 tre gånger, för totalt tre 500μl tvättar.
- Spin en gång på 14.000 gram i rumstemperatur i 1 minut sek, kassera genomströmning.
- Placera SNAP kolumn på en ny 1,5 ml rör.
- Tillsätt 50μl varmt DEPC-vatten (50 ° C) till SNAP Column och inkubera kolonnen vid rumstemp i 1 minut. Eluera cDNA via en snurra på 14.000 g vid rumstemperatur i 1 minut.
- Upprepa steg 2,9, med 100μl varmt DEPC vatten och samma 1,5 ml röret för eluenten.
- Tillsätt 20μl av 3M natriumacetat (pH 5,2) till eluenten från steg 2,9 och 2,10.
- Lägg 3μl av glykogen (20mg/ml) till röret och blanda.
- Tillsätt 500μl av iskall 100% EtOH, blanda väl och inkubera röret i 1 timme vid -80 ° C.
- Spin röret på 14.000 g vid 4 ° C i 20 minuter. Ta försiktigt bort supernatanten.
- Tillsätt 500μl iskallt 70% EtOH och snurra röret på 14.000 g vid 4 ° C i 5 minuter. Ta försiktigt bort supernatanten.
- Lufttorka prov i 5 minuter, se till att alla EtOH tas bort.
- Värm 2X Koppling buffert vid 37 ° C i 5 minuter och återsuspendera cDNA provet i 5μl varmt 2X Koppling buffert.
- Värm cDNA / Koppling buffert vid 50 ° C i 10 minuter och skaka väl. Se till att din cDNA pellets är helt nytt upphängd i 2X Koppling buffert.
Del 3: Märkning med fluorescerande färg
Vid utarbetandet av reaktionen, vara noga med att minimera exponering av färglösningen för ljus. Dessutom är DMSO hygroskopisk och absorberar fukt från luften, som kommer reagera med NHS ester av färgen och avsevärt minska kopplingen reaktionen effektivitet. Håll DMSO medföljer i satsen i en bärnsten skruvkork flaska vid -20 ° C, och låt injektionsflaskan värmas upp till rumstemperatur innan den öppnas för att förhindra kondens. Använd endast DMSO som medföljer denna sats.
- Öppna ett paket med Cy-3 eller Cy-5 Dye och lägga 75μl av DMSO direkt till färgen flaskan.
- Tillsätt 5μl av DMSO / färglösningen till röret från steg 2,18.
- Blanda väl och inkubera röret i rumstemperatur i mörker under 1 timme.
- Tillsätt 20μl av 3M natriumacetat (pH 5,2) till dye-kopplat cDNA lösning.
- Tillsätt 500μl av buffert till cDNA lösningen. Blanda väl genom att vortexa.
- Placera en SNAP kolumn på en tydlig samling rör och ladda cDNA / buffertlösning.
- Snurra på 14.000 gram i rumstemperatur i 1 minut, släng genomströmning.
- Placera SNAP Kolumn på samma samlingröret, lägg 500μl tvättbuffert i kolumnen.
- Snurra på 14.000 gram i rumstemperatur i 1 minut, släng genomströmning.
- Upprepa steg 3. 8-3,9 tre gånger, för totalt tre 500μl tvättar.
- Spin en gång på 14.000 gram i rumstemperatur i 1 minut, släng genomströmning.
- Placera SNAP kolumn på en ny bärnsten provröret.
- Tillsätt 65μl varmt DEPC-vatten (50 ° C) till SNAP Column och inkubera vid rumstemperatur i 1 minut.
- Snurra på 14.000 g vid rumstemperatur i 1 minut och samla genomströmning. Den genomströmning bör innehålla 60μl av renat dye-kopplade cDNA.
Del 4: Utvärdering av märkning arbetsordningen.
- Genomför en spektrofotometer analys för att bedöma varje Cy-cDNA märkning. Beräkna det totala antalet pmol av syntetiskt cDNA: [OD 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg] / 324,5 pg / pmol. Beräkna den totala pmol av aktiebolag Cy-Dye för varje märkning reaktion: pmol Cy3 = [OD 550 x vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [OD 650 X vol.] / 0,25. Därefter beräknar pmol av nukleotid / pmol dye förhållandet för varje reaktion. Optimal reaktioner generera> 6000pmol av cDNA (per 60ul),> 200pmol av Cy-Dye (per 60ul) och en nukleotid / färg förhållande som är <30.
Del 5: Skjut Förtvätt
- Den PtGen2 Array är tryckt på Corning UltraGaps diabilder (amino-silan bestruket) och cDNAs är UV-cross länkade. Skriv fläckar syns tydligt på grund av den höga salthalten i bufferten.
- Använd en diamant spets penna för att markera bilden för övre och nedre delar av utskriftsområde (tillval).
- Sätt ca 250ml förvärmas till 43 ° C 0,2% SDS-lösning i objektglas tvätta skålen (3 "x 4").
- Placera objektglasen i förväg hybridiseras i bilden rack och ett dopp i SDS-lösningen 15-20 gånger mycket kraftfullt för att ta bort salter på bilderna.
- Använd pincett, försiktigt bort bilderna från ställningen och placera dem i en Coplin behållare med Pre-hybridisering Buffer (5X SSC, 0,1% SDS, 1% BSA) som har förvärmas till 43 ° C. Inkubera vid 43 ° C i minst en timme.
Del 6: Pre-hybridisering
- Sätt upp fem bilden diska, var fylld med millipure dH 2 O, och en Coplin burk fylld med molekylär klass isopropanol. Placera bilder i ett bildspel rack och process sekventiellt genom fem rätter av dunking 20 gånger var.
- Ta bort diabilder två åt gången från den femte vattenskrubber och doppa 5-6 gånger i isopropanol och omedelbart plats i glider in i bilden mikrofugrör (Chipmate bänk, 2 positioner) och snurra 1 minut för att torka.
- Rengör glasen med tryckluft filtreras genom ett 0,22 mikroM filterpatron och placera dem med streckkoden uppåt i en Genomic Solutions hybridisering kammaren.
- Rengör LifterSlips ™ med filtrerad luft och placera dem på bilderna med de vita remsorna nedåt. Använd en gul pipettspetsen att försiktigt anpassa lyften halka på bilden (tvätt LifterSlips ™ först i 70% etanol är valfritt. Vi har funnit att det är onödigt.)
Del 7: hybridisering
Bör utföras i mörker eller svagt ljus.
- För varje bild skall hybridiseras, beräkna Cy-5 och Cy-3 märkt cDNA att ge 50-75pmol för varje mål. Kombinera dessa belopp till en enda rör och torka i en vakuumexsickator med värmeläge vid 37-45 ° C. Undvik att torka helt!
- Resuspendera torkade sonder i 60ml hybridisering buffert (gjorde färsk den dagen) och skaka om hastigt.
- Inkubera återsuspenderade cDNAs i 5 minuter i en 95 °-badet och sedan snabbt mikrofug i 30 sekunder.
- Ladda hela återsuspenderade sonden volymen genom att långsamt pipettera på bild-LifterSlip ™ korsningen längst ner (streckkod slutet) av bilden. Bilden laddas genom kapillärkraft. (Vissa föredrar att pipetten på bilden och sedan försiktigt överlagra LifterSlip ™ är detta en ett skott metod sedan om du får bubblor du inte kan flytta LifterSlip ™ efter placering som kan leda till plats smeta artefakter)
- Plats 20uL av 100mm DTT i varje luftfuktigheten ligger väl i ändarna av kammaren.
- Placera toppen på kammaren och dra åt CAM skruvarna. Täck kammaren med aluminiumfolie och doppa i en 48 ° C vattenbad i 12-18 timmar under försiktig omrörning på 50-60 rpm.
Del 8: Post-hybridisering Tvättar
Alla tvättar skall utföras i mörker eller svagt ljus. Diabilder bör aldrig tillåtas att torka tills det sista steget.
- Sätt upp en Coplin burk fylld med tvättlösning # 1 @ 53 ° C, och fyra skjut diska fylld med 250 ml vardera av följande: 1) Waska Lösning # 1 @ 53 ° C, 2) tvättlösning # 2 @ rumstemperatur, 3 och 4) två rätter som innehåller tvättlösning # 3 @ rumstemperatur.
- Ta försiktigt bort bilderna från den hybridisering kamrarna och placera dem två åt gången i Coplin burken. Låt stå i 30 sekunder, lyft sedan glida ut långsamt och lyften slip blir kvar i burken. Placera objektglasen i bilden rack och omedelbart doppa i tvättlösning # 1 (1X SSC, 0,2% SDS, värm till 43 ° C). Upprepa tills alla LifterSlips tas bort och alla bilder som ska tvättas är i tvättlösningen # 1 maträtt. Plunge rack upp och ner 10 gånger kraftigt.
- Placera skålen i 53 ° C i luft shaker med skakning på 50-100 rpm i 10 minuter.
- Överföring racket tvättlösning # 2 (0,1 x SSC, 0,2% SDS), kasta 10 gånger och inkubera vid rumstemperatur, sakta skaka i 10 minuter.
- Doppa rack 15 gånger i den första tvättlösningen # 3 (0,1 x SSC) att ta bort eventuella SDS överföring från tvättlösningen # 2. Placera rack i den andra tvättlösningen # 3 fat, kasta 10 gånger, och sedan sakta skaka i 10 minuter.
- Placera objektglasen i 50mL Falcon tak rör och snurra @ 1500 rpm i centrifugen utrustad med en svängig hink rotor. Ta bort diabilder till ljus impregnerad behållare, använder vi en annan Falcon röret täckt med aluminiumfolie, och rensa luften från röret med kvävgas, locket (detta minskar oxidation av Cy färgämnen, speciellt Cy-5 på sommaren när ozonhalterna är högst ). Diabilder kan lagras i några timmar innan du börjar skanna i rensas kväve rören, men är bäst signal resultat vid skanning sker direkt efter tvätt.
Del 9: datainsamling och statistisk analys
- Skanna bild samlas in om en PerkinElmer ScanArray. Vi använder en 10 mikron skanningsinställning och balans Cy3 och Cy5 signaler med hjälp av metoden linjen justeras enligt tillverkarens anvisningar.
- TIF-filer är inrutade och rå signal som samlas in och filtreras med ImaGene Version 7,5 (BioDiscovery, Inc., El Segundo, CA)
- Data normalisering och utvärdering för att fastställa statistiskt giltiga differentiellt uttryckt arter sker med BRB Array verktyg Ver. 3,7.
- Mönster analys för att underlätta bestämningen av coordinately uttryckt gener sker med Gene Expression Pattern Analysis Software (GEPAS) Ver. 3,1.
Figur 1. Exempel på PtGen2 bearbetas array använder denna protoco l.
Figur 2. Exempel på PtGen2 rad bearbetas med vanliga hybridisering och tvätt protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PtGen2 är en nyligen utvecklad, anpassad cDNA microarray som var avsedd att användas främst av Loblolly tall forskarsamhället. Preliminära givit resultat hittills har visat arrayen att vara ett värdefullt verktyg i utvärderingen av transkriptionell händelser som inträffar till följd av torka stress, samt att övervaka förändringar som sker under embryots utveckling i maritima tall, Pinus pinaster 5,6 Vi har också nyligen visat att PtGen2 fungerar bra i över arter hybridizations med riktade urval isolerad från en rad olika barrträd släkten. 5 Som PtGen2 blir mer utnyttjas av forskare som studerar genuttryck i Pinus och andra arter barrträd, bör denna utbildning videon förse dem med nödvändiga tekniska grunden för att skapa kvalitet och reproducerbara data. I våra händer, gav PtGen2 bättre resultat när bearbetas av strängare hybridisering och tvätt protokoll än de som normalt används i microarray arbete. Andra metoder för behandling av PtGen2 utbud har varit framgångsrika men saknade konsekvens. Efter den tekniska steg som beskrivs här kommer att bidra till att öka samstämmigheten, i synnerhet vid bearbetning av ett stort antal matriser, och kommer också att bidra till att kraftigt minska och eliminera oönskade artefakter och hög bakgrund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Märkning, hybridisering och tvätt protokollen innehåller häri några ändringar av dessa tidigare utvecklat av Dr J. Quackenbush samtidigt som Institutet för genomisk forskning (TIGR), Dr Shawn Levy vid Vanderbilt Microarray Delad Resurs (VMSR), och Dr Rob Alba medan på Boyce Thompson Institute, (BKB) Cornell University.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
| Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
| Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
| Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
| Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
| Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma-Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50mL Conical Tubes | Other | Falcon BD | 352070 | |
| 15mL Conical Tubes | Other | Falcon BD | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
| Coplin Jar | Wheaton | 900520 | ||
| Staining Dish & Rack | Other | Wheaton | 900200 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Other | Sigma-Aldrich | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen | L1014-02 | |
| Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
| System | ||||
| Cy-5 Dye | Reagent | GE Healthcare | PA25001 | |
| Cy-3 Dye | Reagent | GE Healthcare | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Other | Erie Scientific | 25X601 | |
| HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |
References
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
- Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).
- Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. August 25-29, Quebec City, Quebec, , (2008).
- Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. September 24-27, Albena, Bulgaria, , (2008).
