Summary
CDNA mikroarray PtGen2 Loblolly çam gen ekspresyon çalışmaları için geliştirilmiştir
Abstract
PtGen2 amplifiye Loblolly çam EST'ler içeren 26.496 özelliği cDNA mikroarray. Dizi, çam ve diğer kozalaklı türlerin gen ekspresyonu eğitim araştırmacılar tarafından kullanılmak üzere laboratuvarda üretilir. PtGen2 Loblolly çam gen bulma çabalarının bir sonucu olarak geliştirilen ve öncelikle kök dokuları tespit dizileri oluşur, ama aynı zamanda iğne ve kök 1,2 PtGen2 farklı etiketli Cy-boya kozalaklı hedef cDNAs literatürde tarafından test edilmiştir amplifiye ve amplifikatör içermeyen dolaylı etiketleme yöntemleri ve hibridizasyon ve yıkama koşulları bir dizi test. Bu video bazı değişiklikler önceden geliştirilmiş yöntemler kullanılarak, hem de melezleme sonra, ön hibridizasyon öncesi ve sonrası slayt taşıma ve işleme üzerine odaklanmaktadır. 3,4 Ayrıca dahil olanlar, sadece metin biçiminde, üretim için kullanılan protokoller, etiketleme ve hedef cDNA s kadar temiz yanı sıra yazılım hakkında bilgi downstream veri işleme için kullanılır.
PtGen2 tamamen kaldırmak için zor olabilir yüksek konsantrasyonlarda tuz içeren özel bir baskı tamponu ile yazdırılır. Slaytlar ön hibridizasyon için önce sıcak bir SDS çözümü ilk olarak yıkanır. Ön hibridizasyon sonra, slaytlar kalan tuzları kaldırma işleminin tamamlanması için çeşitli değişikliklere su kuvvetlice yıkanır. LifterSlips ™ sonra temizlenmiş ve slaytlar üzerinde konumlandırılmış ve cDNA etiketli dikkatle slaytta örnek eşit dağılımını sağlayan kılcal eylem yoluyla mikroarray üzerine yüklenen ve kabarcık esas şansını azaltır. Dizi hedefleri Hibridizasyon 48 ° C'de yüksek nem koşullarında yapılır. Hibridizasyon sonra, bir dizi standart yıkar 53 yapılır ° C ve oda sıcaklığında uzun zamanlar için. İşleme PtGen2 slaytlar bu tekniği kullanarak tuz azaltır ve SDS-elde edilen eserler genellikle dizi daha titiz bir şekilde işlenir. Birkaç farklı kozalaklı RNA kaynaklardan elde edilen hedeflere literatürde, bu işlem protokolü, daha az eser, azaltılmış arka plan verdi ve dizilerin farklı deneysel gruplar arasında daha tutarlı.
Protocol
(Not 1 - 4 Bölüm Video kanıtlanmış değil)
Cy-Etiketli Hedef cDNA hazırlanması
Aşağıda biz döllemeler mikroarray önce Loblolly çam toplam RNA ve dolaylı cDNA etiketleme cDNA sentezi için kullanılan bir protokoldür. Olmayan birkaç önemsiz değişiklikler yapılmış olmasına rağmen, aşağıdaki protokol Invitrogen Üst Simge Dolaylı cDNA Etiketleme Kit ile birlikte verilen kullanım kılavuzuna benzer.
Bölüm 1: İlk Strand cDNA Sentezi Reaksiyonu
- Mix ve kullanmadan önce kısaca her kiti bileşeni spin.
- Reaksiyonlar aşağıdaki gibi hazırlayın:
- Xμl DEPC-H 2 O
- Xμl toplam RNA, 20 mikrogram / reaksiyonu (Ambion Turbo DNaz ile ön işlem)
- 2μl Ankrajlı Oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl)
- 1μl Rastgele Hexamer Astar
- Toplam Hacim = 18μl
- 70 1-2 dakika boyunca buz üzerinde ° C, daha sonra 5 dakika yer ve tüpler inkübe edin.
- Her reaksiyon tüpüne buz üzerinde aşağıdakileri ekleyin:
- 6μl 5X İlk Strand tampon
- 1.5μl 0.1M DTT
- 1.5μl 10mM dNTP mix
- 1μl RNaseOUT (40U/μl)
- 2μl Üst Simge III RT (400U/μl)
- Yavaşça karıştırın ve kısaca döndürün. Gecede tüp inkübe 45 ° C.
- Her reaksiyon tüpüne 1M NaOH 15μl ekleyin ve iyice karıştırın.
- Tüp 70 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
- 1M HCl 15μl ekleyin, hafifçe karıştırın.
- 20μl 3M sodyum asetat (pH 5.2) ekleyin; hafifçe karıştırın.
Bölüm 2: Arındırıcı İlk Strand cDNA.
- CDNA (Adım 1.9) Tampon Yükleme 500μl ekleyin ve iyice karıştırın.
- SNAP Arıtma Sütun (Dolaylı Etiketleme kiti ile birlikte) bir toplama tüpüne yerleştirin ve sütun cDNA yük.
- Oda sıcaklığında 1 dakika 14.000 g Spin, flow-through atın.
- SNAP Sütun aynı toplama tüpü üzerine yerleştirin ve Wash Buffer 500μl eklemek.
- Oda sıcaklığında 1 dakika 14.000 g Spin, flow-through atın.
- Toplam üç 500μl yıkar, Adımlar 2.4 ve 2.5 üç kez tekrarlayın.
- 1 dakika saniye boyunca oda sıcaklığında bir kez daha 14.000 g Spin, flow-through atın.
- SNAP Sütun 1.5ml yeni bir boru üzerine yerleştirin.
- SNAP Sütun ve 1 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe sütun sıcak DEPC-su (50 ° C) 50μl ekleyin. 1 dakika 14.000 gr oda sıcaklığında bir spin ile cDNA Zehir.
- DEPC sıcak su 100μl ve Eluent için aynı 1.5ml tüp kullanarak, Adım 2.9 tekrarlayın.
- 20μl 3M sodyum asetat (pH 5.2), 2.9 ve 2.10 adımları Eluent ekleyin.
- Glikojen (20mg/ml) tüp ve karıştırın 3μl ekleyin.
- Buz gibi% 100 EtOH 500μl ekle, iyice karıştırın ve 1 saat için tüp -80 inkübe ° C
- 14.000 g tüp Spin 4 ° C 20 dakika. Süpernatantı dikkatlice çıkartın.
- Buz% 70 EtOH 500μl ekleyin ve 4 g 14.000 tüp spin ° C 5 dakika. Süpernatantı dikkatlice çıkartın.
- 5 dakika boyunca örnek Hava kuru; tüm EtOH kaldırılmış olduğundan emin olun.
- 5 dakika ° 37 ° C 2X Kaplin Tampon Sıcak ve ılık 2X Kaplin Tampon 5μl cDNA örnek yeniden askıya.
- 50 / cDNA Kaplin tampon Isı ° C de 10 dakika ve vorteks için iyi. CDNA pelet tamamen 2X Kaplin Tampon yeniden askıya olduğundan emin olun.
Bölüm 3: Floresan Boya Etiketleme
Reaksiyon hazırlanırken, boya çözüm ışığa maruz kalma en aza indirmek için dikkatli olun. Ayrıca, DMSO higroskopik ve boya NHS ester ile reaksiyona ve kaplin reaksiyon verimi önemli ölçüde azaltacaktır hava, nem absorbe edecektir . -20 ° C'de bir kehribar vidalı kapaklı flakon kiti verilen DMSO tutun ve yoğuşmayı önlemek için açmadan önce oda sıcaklığına kadar flakon sıcak sağlar. Sadece bu kit ile birlikte verilen DMSO kullanın.
- Cy-3 veya Cy-5 Boya bir paket açın ve boya flakon doğrudan DMSO, 75μl ekleyin.
- Adım 2.18 tüp DMSO / boya çözüm 5μl ekleyin.
- İyice karıştırın ve tüp, karanlık oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
- 3M sodyum asetat (pH 5.2) 20μl boya birleştiğinde cDNA çözüm ekleyin.
- CDNA çözüm Tampon Yükleme 500μl ekle. Vorteks ile iyice karıştırın.
- SNAP Sütun açık bir toplama tüpü üzerine yerleştirin ve cDNA / tampon çözelti yük.
- Oda sıcaklığında 1 dakika 14.000 g Spin, flow-through atın.
- Aynı toplama SNAP Sütun yerleştirin.tüp; Yıkama Tamponu 500μl sütun ekleyin.
- Oda sıcaklığında 1 dakika 14.000 g Spin, flow-through atın.
- Tekrar 3 Adımlar. 8-3,9 üç kez, toplam üç 500μl yıkar.
- 1 dakika boyunca oda sıcaklığında bir kez daha 14.000 g Spin, flow-through atın.
- SNAP Sütun yeni bir kehribar toplama tüpü üzerine yerleştirin.
- 1 dakika oda sıcaklığında SNAP Kolon ve inkübe sıcak DEPC-su (50 ° C) 65μl ekleyin.
- 1 dakika 14.000 gr oda sıcaklığında Spin ve flow-through toplamak. Flow-through cDNA boya birleştiğinde saflaştırılmış 60μl içermelidir.
Bölüm 4: Etiketleme Usul değerlendirilmesi.
- Her Cy-cDNA etiketleme değerlendirmek için bir spektrofotometre tahlil gerçekleştirin. Sentezlenen cDNA pmol toplam sayısını hesaplayın: [OD 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg / 324,5 pg / pmol. Her etiketleme reaksiyon için toplam dahil Cy-Boya pmol hesaplayın: pmol Cy3 = [OD 550 X vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [OD 650 X vol.] / 0,25. Sonra, her bir reaksiyon için pmol / nükleotid boya oranı pmol hesaplar. Optimal reaksiyonlar> oluşturmak 6000pmol cDNA (kisi 60ul)> 200pmol Cy-Boya (60ul başı), <30 nükleotid / boya oranı.
Bölüm 5: Slayt Ön Yıkama
- PtGen2 Array Corning UltraGaps slaytlar (amino-silan kaplı) yazdırılır ve cDNAs UV-çapraz bağlı. Baskı noktalar tampon yüksek tuz içeriği nedeniyle açıkça görülebilir.
- Baskı alanı (isteğe bağlı) üst ve alt alanlar için slayt işaretlemek için bir elmas uçlu kalem kullanın.
- Koyun yaklaşık 250 ml 43 önceden ısıtılmış ° C mikroskop lamı yıkama çanak (3 "x 4") içine% 0.2 SDS çözüm.
- Yeri slaytlar slayt slaytlar tuzları kaldırmak için 15-20 kez çok şiddetle SDS çözümü içine raf ve dalma-melezleşmiştir.
- Forseps kullanarak dikkatli bir şekilde rafa slaytları çıkarın ve 43 ° C önceden ısıtılmış hibridizasyon Ön Tampon (5X SSC,% 0,1 SDS,% 1 BSA) içeren bir Coplin kavanoza koyun En az bir saat için 43 ° C'de inkübe edin.
Bölüm 6: Pre-Hibridizasyon
- Beş slayt yıkama yemekleri, her biri millipure dH 2 O dolu ve moleküler sınıf izopropanol ile dolu bir Coplin kavanoz ayarlayın . Slaytları slayt rafa yerleştirin ve her biri 20 kez dunking beş yemekleri sıralı süreci.
- Kaldır beşinci slayt mikrofuge'de (Chipmate masa üstü, 2 pozisyon) içine slaytlar izopropanol ve hemen su ile yıkayınız ve daldırma 5-6 kez bir seferde iki slaytlar ve kuruması için 1 dakika döndürün.
- Temizlik slaytlar sıkıştırılmış hava ile 0.22 mcM filtre kartuşu süzülür ve Genomik Çözümler Hibridizasyon Odası yukarı bakacak şekilde barkod koyun.
- Temiz LifterSlips ™ filtreli hava ve aşağı bakacak şekilde beyaz şeritler ile slaytları pozisyon. Sarı bir pipetlemeyin ucu hafifçe slayt kaldırıcı kayma hizalamak için kullanın (% 70 etanol ™ ilk LifterSlips Yıkama isteğe bağlıdır. Gereksiz bulduk.)
Bölüm 7: Hibridizasyon
Karanlık veya düşük ışık yapılmalıdır.
- Melezleşmiştir her slayt için, Cy-5 miktarını hesaplamak ve CY-3, her bir hedef 50-75pmol vermek için cDNA etiketli. 37-45 tek bir tüp içine bu miktarda ısı ayarı ile birleştirin ve bir vakum desikatörde kuru ° C Tamamen kuruyan kaçının!
- Kurutulmuş 60ml hibridizasyon tamponu sondalar (o gün taze yapılmış) ve vorteks kısaca tekrar
- 5 dakika 30 saniye süreyle 95 ° C banyo ve daha sonra hızlı mikrofuge'de yeniden süspanse cDNAs inkübe edin.
- Yavaş yavaş slayt altındaki slayt LifterSlip ™ kavşağı (barkod sonu) pipetleme tamamını yeniden süspanse prob hacmi yükleyin. Slayt kapiler eylem yoluyla yük olacaktır. (Bazı slayt pipet ve yavaşça LifterSlip bindirme ™ bu kabarcıkları alırsanız LifterSlip ™ bulaşması eserler noktaya yol açabilir yerleştirildikten sonra hareket etmez, çünkü bir çekim yöntemi tercih edin)
- Her nem 100 mM DTT Yeri 20uL odasının ucunda yer almaktadır.
- Odanın en üst yerleştirin ve cam vidalarını sıkın. Kapak alüminyum folyo ve yavaşça sallanarak rpm'de 50-60 ile 12-18 saat 48 ° C su banyosu içine batırmayın odası.
Bölüm 8: Post-Hibridizasyon yıkar
Tüm yıkar, karanlık veya düşük ışık yapılmalıdır . Slaytlar son adıma kadar kuruması için asla izin verilmemeli.
- 1) W: Yıkama Çözüm # 1 @ 53 ° C Aşağıdaki her 250 ml ile dolu ve dört slayt yıkama yemekleri ile dolu bir Coplin kavanozkül Çözüm # 1 @ 53 ° C, 2) Yıkama Çözüm # 2 @ oda sıcaklığında, 3 ve 4) Yıkama Çözüm # 3 @ oda sıcaklığında içeren iki çanak.
- Dikkatle hibridizasyon odalarından slaytlar kaldırmak ve onları iki sırayı Coplin kavanoza bir seferde. 30 saniye boyunca bırakın, sonra yavaş yavaş slayt asansör ve kaldırıcı kayma kavanoz kalacaktır. Slaytlar slayt raf ve hemen Yıkama Çözeltisi # 1 (1X SSC,% 0.2 SDS, ön ısıtma 43 ° C) içine batırmayın. Tüm LifterSlips kaldırılır ve yıkanabilir tüm slaytlar Yıkama Çözeltisi # 1 tabak kadar tekrarlayın. Gayretle 10 kat kadar rafa batırın ve aşağı.
- Yeri çanak 53 ° C de 10 dakika 50-100 rpm çalkalama hava çalkalayıcı.
- Transferi, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında Çözüm # 2 (0.1x SSC,% 0.2 SDS), 10 kez dalma ve inkübe Wash raf sallayarak yavaş.
- Dip raf ilk Yıkama Çözüm # 3 (0.1x SSC) içine 15 kez kaldırmak için herhangi bir kalıntı SDS Yıkama Çözüm # 2 üzerinde taşır. Ikinci Yıkama Çözüm Yeri raf # 3 çanak, dalma 10 kez ve daha sonra 10 dakika boyunca sallayarak yavaş.
- Santrifüj 50ml Falcon kapaklı tüpler ve spin @ 1,500 rpm Yeri slaytlar sallanan bir kova rotor ile donatılmıştır. Yalıtımlı konteyner ışık slaytlar çıkarın (ozon seviyeleri yüksek olduğunda bu yaz özellikle Cy boyalar, Cy-5 oksidasyonu azaltır sıkıca alüminyum folyo kaplı başka Falcon tüp ve azot gazı tüpünden tasfiye hava, şapka kullanın .) Slaytlar, bir kaç saat önce azot tasfiye tüpler tarama süreyle saklanabilir; Ancak, hemen yıkandıktan sonra tarama bittiğinde iyi sinyal sonuçlar elde edilmektedir.
Bölüm 9: Veri Toplama ve İstatistiksel Analiz
- Tarama görüntü verilerini Perkin Elmer ScanArray toplanır. Biz 10 mikron tarama ayarı ve dengesi Cy3 ve üreticinin talimatlarına göre satır ayarlama yöntemi kullanılarak Cy5 sinyalleri kullanırlar.
- TIF dosyalarını ızgara ve ham sinyal veri ImaGene Sürüm 7.5 (BioDiscovery A.Ş., El Segundo, CA) ile toplanır ve süzülür.
- Veri normalleşme ve istatistiksel olarak geçerli farklı ifade türlerin belirlemek için değerlendirme BRB Dizi araçları Ver ile yapılır. 3.7.
- Gen İfadesi Örüntü Analizi Yazılımı (GEPAS) Ver koordineli olarak ifade edilen genlerin belirlenmesi kolaylaştırmak için desen analizi yapılır. 3.1.
Şekil 1 PtGen2 dizi bu protoco l. kullanarak işleme örneği
Şekil 2 standart hibridizasyon ve yıkama protokolleri kullanarak işlenmiş PtGen2 dizi örneği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PtGen2 öncelikle Loblolly çam araştırma topluluğu tarafından kullanılmak üzere tasarlanmış kısa bir süre önce geliştirilen, özel cDNA mikroarray. Üretilen ön sonuçları, bu nedenle çok değerli bir araç transkripsiyonel kuraklık stresine yanıt olarak ortaya çıkan olayların yanı sıra, deniz, çam, Pinus pinaster Şu anda 5,6 embriyo gelişimi sırasında meydana gelen değişiklikleri izleme gibi değerlendirilmesi için dizi göstermiştir yakın zamanda 5 PtGen2 olarak, Pinus ve diğer kozalaklı türlerin gen ekspresyonu çalışan araştırmacılar tarafından kullanılan, çeşitli kozalaklı cins izole hedef örnekler kullanılarak çapraz türlerin döllemeler PtGen2 çalışır. Bu eğitim video gerekli sağlamak gerektiğini göstermiştir teknik temeli kaliteli ve tekrarlanabilir verileri oluşturmak. Genellikle mikroarray çalışma istihdam edilenler daha sıkı hibridizasyon ve yıkama protokolleri tarafından işlenen PtGen2 bizim ellerde, daha iyi sonuçlar vermiştir. PtGen2 dizi işleme Diğer yaklaşımlar başarılı ama tutarlılık yoksun. Burada açıklanan teknik adımları izleyerek, tutarlılığını artırmak için ve özellikle diziler çok sayıda işleme yardımcı olacak, hem de istenmeyen kalıntıları ve yüksek arka planlar büyük ölçüde azaltmak ve ortadan kaldırmak için yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Etiketleme, hibridizasyon ve yıkama protokolleri burada bazı Dr. J. Quackenbush, Genom Araştırma (TIGR), Vanderbilt Mikroarray Paylaşımlı Kaynak (VMSR) Dr. Shawn Levy Enstitüsü'nde ise daha önce geliştirilen bu modifikasyon, ve Dr. Içeren Rob Alba Boyce Thompson Enstitüsü, (BTI) Cornell Üniversitesi sırasında.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
| Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
| Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
| Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
| Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
| Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma-Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50mL Conical Tubes | Other | Falcon BD | 352070 | |
| 15mL Conical Tubes | Other | Falcon BD | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
| Coplin Jar | Wheaton | 900520 | ||
| Staining Dish & Rack | Other | Wheaton | 900200 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Other | Sigma-Aldrich | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen | L1014-02 | |
| Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
| System | ||||
| Cy-5 Dye | Reagent | GE Healthcare | PA25001 | |
| Cy-3 Dye | Reagent | GE Healthcare | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Other | Erie Scientific | 25X601 | |
| HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |
References
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
- Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).
- Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. August 25-29, Quebec City, Quebec, , (2008).
- Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. September 24-27, Albena, Bulgaria, , (2008).
