ES Cell-afgeleide neuro-epitheliale cel culturen

Summary

Afleiding van neuro voorlopers uit embryonale stamcellen (ES)-cellen met behulp van stromale cel afkomstige inducerende activiteit (SDIA).

Abstract

ES-cellen hebben de potentie om te differentiëren in de cellen van alle kiembladen, waardoor ze een aantrekkelijk instrument voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën. In het algemeen is de differentiatie van ES-cellen volgt het concept om eerst te genereren onvolgroeide stamcellen, die vervolgens kunnen worden uitgedragen en gedifferentieerd tot volgroeide cellulaire fenotypes. Dit geldt ook voor de ES-cel afgeleide neurogenese, waarin de ontwikkeling van zenuwcellen volgt twee belangrijke stappen: Ten eerste, de afleiding en de uitbreiding van onvolwassen neuro precursoren en seconden, hun differentiatie tot volwassen neurale cellen. Een veel voorkomende methode om neurale voorlopercellen te produceren uit ES-cellen is gebaseerd op embryoid lichaam (EB) formatie, waarin de differentiatie van cellen uit alle kiembladen inclusief neuroectoderm onthult. Een alternatief en meer efficiënte methode om neuro-epitheliale cel ontwikkeling te induceren maakt gebruik van stromale cel afkomstige inducerende activiteit (SDIA), die kan worden bereikt door co-kweken van embryonale stamcellen met de schedel beenmerg-afgeleide stromale cellen (1). Beide, EB vorming en SDIA, onthullen de ontwikkeling van de rozet-achtige structuren, die worden verondersteld om neurale buis lijken op-en / of neurale crest-achtige voorouders. De neurale voorlopers kunnen worden geïsoleerd, uitgebreid en verder gedifferentieerd in specifieke neuronen en glia cellen met behulp van bepaalde kweekomstandigheden. We beschrijven hier de generatie en het isolement van deze rozetten in co-cultuur van experimenten met de stromale cellijn MS5 (2-5).

Protocol

Stap 1

1. Plaat mitomycine-C ggrowth-remde (10 ug / ml voor 2,5 uur) MS5 cellen bij een dichtheid van 70.000 / cm2 op gelatine gecoate (0,01% gedurende 30 minuten) 6 goed platen in de α-MEM media.
2. Wanneer de cellen worden bevestigd en hebben gevormd een monolaag ('s nachts groei), overschakelen naar SRM.
3. Handmatig isoleren ES-cel kolonies van de ES-celkweken met behulp van een injectiespuit met een 27 ½ G naald.
4. Zorgvuldig Tritrurate de kolonies met een 1 ml blauw tip en de plaat bij een lage dichtheid op de MS5 cellen (meestal 2-3 kolonies per 6 wells plaat).

Opmerking: De ES-cellen kunnen ook worden genomen van enzymatische propagatie met collagenase of trypsine.

Stap 2

1. Groei van de ES-cellen op de MS5 feeders voor 14-21 dagen tot de rozet-bevattende kolonies te vormen.

Let op: Wijzig media vaak. De rozetten zijn meestal op de buitenste randen van de kolonies en hun vorming kunnen sterk worden verbeterd wanneer 300-500 ng / ml Noggin wordt toegevoegd aan de SRM (3). In sommige differentiatie protocollen, kan SRM worden uitgewisseld met N2-A media en aangevuld met groei of andere factoren naar cel specificatie (2-5) te bevorderen.

Stap 3

1. Isoleren en kies de rozetten met een 27 ½ G naald onder een microscoop.

Opmerking: Vermijd het snijden en het plukken van de MS5 stromale cellen. Als kolonies worden verpakt met rozetten, kan men ook de oorzaak van het hele kolonie.

Stap 4

1. Aspireren de clusters van rozetten, zorgvuldig tritrurate ze met een 1 ml blauwe tip, en de plaat ze op poly-L-ornithine (0,001%) en fibronectine (1 ug / ml) of laminine (1 ug / ml)-gecoate 6 putten in N2-A media meestal aangevuld met bFGF (20 ng / ml). De rozetten zal hervormen en uitbreiden.

Opmerking: Om overleving van de cel te verbeteren, kan men het bord van de kleine clusters in druppeltjes naar cel dichtheid te verhogen. Deze stap kan ook worden gewijzigd door een aanvulling van de N2-A media met extra groei of andere factoren die de cel-specificatie (2-5) te bevorderen.

Discussion

Dit protocol laat de verschillende stappen in het genereren en het isoleren van neuro-epitheliale cellen van menselijke ES-cellen met behulp van SDIA. De toepassing van deze methode is veelzijdig en is gebruikt in tal van protocollen tot bepaalde neuronen produceren (bijv. 1, 2, 5-9). De rozetten worden verondersteld om neurale buis cellen met een voorste fenotype (2, 5, 10) lijken en ook de neurale lijst voorvaderen (11, 12) bevatten. Bovendien behouden ze een zekere mate van plasticiteit, omdat ze kunnen worden patroon door specifieke factoren in gedefinieerde kweekomstandigheden. Zo kan de SDIA-afgeleide neurale voorlopercellen aanleiding geven tot veel soorten cellen uit het centrale en perifere zenuwstelsel waardoor ze een nuttig instrument voor de afleiding van verschillende neurale celpopulaties in ES celdifferentiatie paradigma's.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
L-Glutamine		GIBCO, by Life Technologies	25030
alpha-MEM		GIBCO, by Life Technologies	12571
Penicillin/streptomycin		GIBCO, by Life Technologies	15140
Knockout-DMEM		GIBCO, by Life Technologies	10829
Knockout serum replacement		GIBCO, by Life Technologies	10828
MEM nonessential amino acid solution		GIBCO, by Life Technologies	12383
DMEM/F12		GIBCO, by Life Technologies	11330
N2-A supplement		Stem Cell Technologies	07152
Mitomycin-C		Sigma-Aldrich	M0503
Gelatine type-A		Sigma-Aldrich	G1890
poly-L-ornithine		Sigma-Aldrich	P4957	0.01% solution
Laminin		Sigma-Aldrich	L-2020
Fibronectin		Sigma-Aldrich	F2006
Basic fibroblast growth factor (bFGF)		Invitrogen	13256
1 mL Syringe with 27 1/2 G needle		BD Biosciences	309623
N2-A media	medium			DMEM/F12 + 1% N2-A supplement
Serum replacement media (SRM)	medium			Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement +1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine
α-MEM media	medium			α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin
MS5	cell line			stromal cells
Microscope
6-well Plates				for tissue culture