ES Cell dérivé des cultures cellulaires neuroépithéliales

Summary

Dérivation de précurseurs d'neuroépithéliales souches embryonnaires (ES), les cellules stromales en utilisant l'activité induisant des cellules dérivées (SDIA).

Abstract

Les cellules ES ont le potentiel de se différencier en cellules de tous les feuillets embryonnaires, ce qui en fait un outil intéressant pour le développement de nouvelles thérapies. En général, la différenciation des cellules ES suit le concept d'abord générer des cellules progénitrices immatures, qui peuvent ensuite être multipliées et différenciées en maturité phénotypes cellulaires. Ceci s'applique également pour les dérivés de cellules ES neurogenèse, dans lequel le développement des cellules neurales suit deux grandes étapes: d'abord, la dérivation et l'expansion des précurseurs immatures neuroépithéliales et deuxièmement, leur différenciation en cellules matures neurones. Une méthode courante pour produire progéniteurs neuronaux à partir des cellules ES est basé sur le corps (EB) la formation embryoïdes, qui révèle la différenciation des cellules de tous les feuillets embryonnaires, y compris neuroectoderme. Une méthode alternative et plus efficace pour induire le développement des cellules stromales neuroépithéliales utilise l'activité induisant des cellules dérivées (SDIA), qui peut être atteint par les cellules ES co-culture avec l'os du crâne dérivées de la moelle des cellules stromales (1). Les deux, la formation EB et SDIA, révèlent le développement de la rosette de structures semblables, qui sont pensés pour ressembler à du tube neural et / ou de la crête neurale, comme géniteurs. Les précurseurs de neurones peuvent être isolés, étendus et différenciées en neurones spécifiques et les cellules gliales en utilisant des conditions de culture définie. Ici, nous décrivons la génération et l'isolement de ces rosettes en co-culture des expériences avec la ligne de cellules stromales MS5 (2-5).

Protocol

Etape 1

1. Plaque mitomycine C ggrowth-inhibée (10 pg / ml pendant 2,5 heures) MS5 cellules à une densité de 70.000 / cm2 sur la gélatine-couché (0,01% pour 30 minutes) 6 assiettes bien dans α-MEM médias.
2. Lorsque les cellules sont attachés et ont formé une monocouche (plus de la croissance de nuit), passer à SRM.
3. Manuellement isoler les colonies de cellules ES à partir des cultures de cellules ES à l'aide d'une seringue avec une aiguille de 27 G ½.
4. Tritrurate les colonies soigneusement avec une pointe de 1 ml bleu et plaque à faible densité sur les cellules MS5 (habituellement 2-3 colonies par plaque de 6 puits).

Remarque: Les cellules ES peuvent également être prises à partir de propagation enzymatique utilisant la collagénase ou de trypsine.

Etape 2

1. Cultiver les cellules ES sur la MS5 mangeoires pendant 14-21 jours, jusqu'à rosette contenant former des colonies.

Remarque: Les médias changent souvent. Les rosettes sont généralement à la périphérie des colonies et leur formation peut être grandement améliorée si 300-500 ng / ml Caboche est ajouté à la MRS (3). Dans certains protocoles de différenciation, les MRS peuvent être échangées avec N2-A médias et complétée par la croissance ou d'autres facteurs afin de promouvoir la spécification des cellules (2-5).

Étape 3

1. Isoler et ramasser les rosettes avec une aiguille de calibre 27 ½ sous un microscope.

Remarque: Evitez de couper et ramasser l'MS5 cellules stromales. Si les colonies sont emballés avec des rosettes, on peut également isoler la colonie entière.

Etape 4

1. Aspirer les grappes de rosettes, les tritrurate soigneusement avec une pointe de 1 ml bleu, et la plaque eux sur la poly-L-ornithine (0,001%) et de la fibronectine (1 pg / ml) ou de la laminine (1 pg / ml) à revêtement 6 puits dans N2-Un média habituellement complétées avec bFGF (20 ng / ml). Les rosettes seront réforme et l'expansion.

Remarque: Pour améliorer la survie des cellules, on peut l'assiette du petites grappes dans les gouttelettes d'augmenter la densité cellulaire. Cette étape peut également être modifié en complétant la N2-Un média avec une croissance supplémentaires ou d'autres facteurs afin de promouvoir la spécification des cellules (2-5).

Discussion

Ce protocole démontre les différentes étapes de production et d'isoler les cellules neuro-épithéliales des cellules ES humaines à l'aide de SDIA. L'application de cette méthode est multiple et a été utilisé dans de nombreux protocoles à produire des neurones spécifiés (par exemple 1, 2, 5-9). Les rosettes sont pensé pour ressembler à des cellules du tube neural avec un phénotype antérieure (2, 5, 10) et contiennent aussi des progéniteurs de la crête neurale (11, 12). De plus, ils conservent un certain niveau de plasticité, car ils peuvent être modelée par des facteurs spécifiques dans des conditions de culture définie. Ainsi, les progéniteurs neuronaux SDIA dérivés peuvent donner lieu à de nombreux types cellulaires du système nerveux central et périphérique qui en fait un outil utile pour la dérivation des différentes populations de cellules neurales dans les paradigmes de la différenciation des cellules ES.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
L-Glutamine		GIBCO, by Life Technologies	25030
alpha-MEM		GIBCO, by Life Technologies	12571
Penicillin/streptomycin		GIBCO, by Life Technologies	15140
Knockout-DMEM		GIBCO, by Life Technologies	10829
Knockout serum replacement		GIBCO, by Life Technologies	10828
MEM nonessential amino acid solution		GIBCO, by Life Technologies	12383
DMEM/F12		GIBCO, by Life Technologies	11330
N2-A supplement		Stem Cell Technologies	07152
Mitomycin-C		Sigma-Aldrich	M0503
Gelatine type-A		Sigma-Aldrich	G1890
poly-L-ornithine		Sigma-Aldrich	P4957	0.01% solution
Laminin		Sigma-Aldrich	L-2020
Fibronectin		Sigma-Aldrich	F2006
Basic fibroblast growth factor (bFGF)		Invitrogen	13256
1 mL Syringe with 27 1/2 G needle		BD Biosciences	309623
N2-A media	medium			DMEM/F12 + 1% N2-A supplement
Serum replacement media (SRM)	medium			Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement +1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine
α-MEM media	medium			α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin
MS5	cell line			stromal cells
Microscope
6-well Plates				for tissue culture