ES Cell-derivati ​​colture cellulari neuroepiteliale

Summary

Derivazione di precursori neuroepiteliale da staminali embrionali (ES), le cellule stromali utilizzando cellule derivate attività induttiva (SDIA).

Abstract

Le cellule staminali hanno la potenzialità di differenziarsi in cellule di tutti i foglietti embrionali, che li rende uno strumento interessante per lo sviluppo di nuove terapie. In generale, la differenziazione delle cellule staminali embrionali segue il concetto di generare prime cellule progenitrici immature, che poi possono essere propagate e differenziato in maturo fenotipi cellulari. Ciò vale anche per ES derivati ​​dalle cellule neurogenesi, in cui lo sviluppo delle cellule neurali segue due fasi principali: in primo luogo, la derivazione e l'espansione di precursori immaturi neuroepiteliale e la seconda, la loro differenziazione in cellule nervose mature. Un metodo comune per la produzione di progenitori neurali da cellule staminali embrionali è basato sul corpo (EB) la formazione, che rivela la differenziazione delle cellule germinali da tutti i livelli compresi neuroectoderma. Un metodo alternativo e più efficiente per indurre lo sviluppo neuroepiteliale cella utilizza cellule stromali derivate attività induttiva (SDIA), che può essere raggiunto da co-colture di cellule ES con l'osso del cranio derivate dal midollo cellule stromali (1). Entrambi, formazione EB e SDIA, rivelano lo sviluppo di rosetta-come le strutture, che si pensa ad assomigliare a tubo neurale e / o cresta neurale, come progenitori. I precursori neurali possono essere isolati, ampliato e ulteriormente differenziate in neuroni e cellule gliali specifici utilizzando condizioni di coltura definiti. Qui, descriviamo la generazione e l'isolamento di queste rosette in co-coltura esperimenti con la linea di cellule stromali MS5 (2-5).

Protocol

Fase 1

1. Piastra mitomicina-C ggrowth inibito (10 mg / ml per 2,5 ore) MS5 cellule ad una densità di 70.000 / cm2 di gelatina rivestita (0,01% per 30 minuti) 6 piastre in α-MEM media.
2. Quando le cellule sono collegate e hanno formato un monostrato (oltre crescita notte), passare a SRM.
3. Manualmente isolare colonie di cellule ES da colture di cellule ES usando una siringa con un ago 27 ½ G.
4. Tritrurate le colonie accuratamente con una punta di 1 ml di blu e la piastra a bassa densità sul MS5 cellule (di solito 2-3 colonie per 6 pozzetti).

Nota: Le cellule ES possono anche essere prelevati da propagazione enzimatica con collagenasi e tripsina.

Fase 2

1. Crescere le cellule ES sul MS5 alimentatori per 14-21 giorni fino a rosetta contenenti formano colonie.

Nota: i media cambiano spesso. Le rosette sono di solito ai bordi esterni delle colonie e la loro formazione può essere notevolmente migliorata se 300-500 ng / ml Noggin viene aggiunto al SRM (3). In alcuni protocolli di differenziazione, SRM possono essere scambiati con N2-A media e integrata con altri fattori di crescita o di promuovere specifiche cellule (2-5).

Fase 3

1. Isolare e scegliere le rosette con un 27 ½ ago G al microscopio.

Nota: Evitare di tagliare e scegliere i MS5 cellule stromali. Se le colonie sono pieni di rosette, si può anche isolare l'intera colonia.

Fase 4

1. Aspirare il cluster di rosette, li tritrurate accuratamente con una punta di 1 ml blu, e la piastra li poli-L-ornitina (0,001%) e fibronectina (1 mg / ml) o laminina (1 mg / ml) rivestita 6 pozzi in N2-Una media di solito integrati con bFGF (20 ng / ml). Le rosette si riforma e si espandono.

Nota: per migliorare la sopravvivenza delle cellule, si possono piatto i cluster di piccole gocce di aumentare la densità delle cellule. Questa fase può anche essere modificata, che completa l'N2-A media con un'ulteriore crescita o altri fattori di promuovere la specificazione delle cellule (2-5).

Discussion

Questo protocollo mostra le diverse fasi di generazione e isolare le cellule neuroepiteliale da cellule staminali embrionali umane usando SDIA. L'applicazione di questo metodo è molteplice ed è stato utilizzato in molti protocolli di produrre neuroni specificato (ad esempio 1, 2, 5-9). Le rosette sono pensati per assomigliare a cellule del tubo neurale con un fenotipo anteriore (2, 5, 10) e contengono anche progenitori della cresta neurale (11, 12). Inoltre, essi mantengono un certo grado di plasticità, in quanto possono essere modellata da fattori specifici in condizioni di coltura definiti. Così, il SDIA derivato progenitori neurali possono dare origine a molti tipi di cellule del sistema nervoso centrale e periferico che li rende uno strumento utile per la derivazione di diverse popolazioni di cellule neurali in paradigmi differenziazione delle cellule ES.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
L-Glutamine		GIBCO, by Life Technologies	25030
alpha-MEM		GIBCO, by Life Technologies	12571
Penicillin/streptomycin		GIBCO, by Life Technologies	15140
Knockout-DMEM		GIBCO, by Life Technologies	10829
Knockout serum replacement		GIBCO, by Life Technologies	10828
MEM nonessential amino acid solution		GIBCO, by Life Technologies	12383
DMEM/F12		GIBCO, by Life Technologies	11330
N2-A supplement		Stem Cell Technologies	07152
Mitomycin-C		Sigma-Aldrich	M0503
Gelatine type-A		Sigma-Aldrich	G1890
poly-L-ornithine		Sigma-Aldrich	P4957	0.01% solution
Laminin		Sigma-Aldrich	L-2020
Fibronectin		Sigma-Aldrich	F2006
Basic fibroblast growth factor (bFGF)		Invitrogen	13256
1 mL Syringe with 27 1/2 G needle		BD Biosciences	309623
N2-A media	medium			DMEM/F12 + 1% N2-A supplement
Serum replacement media (SRM)	medium			Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement +1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine
α-MEM media	medium			α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin
MS5	cell line			stromal cells
Microscope
6-well Plates				for tissue culture