Summary
Derivação de precursores de neuroepiteliais-tronco embrionárias (ES) utilizando células do estroma atividade induzir células derivadas (SDIA).
Abstract
Células-tronco embrionárias têm o potencial de se diferenciar em células de todas as camadas germinativas, o que os torna uma ferramenta atraente para o desenvolvimento de novas terapias. Em geral, a diferenciação de células-tronco embrionárias segue o conceito para a primeira geração de células progenitoras imaturas, que depois podem ser propagadas e diferenciado em fenótipos maduros celular. Isto também se aplica para o ES neurogênese células derivada, em que o desenvolvimento de células neurais segue duas etapas principais: Primeiro, a derivação ea expansão de precursores imaturos neuroepiteliais e, segundo, sua diferenciação em células maduras neural. Um método comum para a produção de progenitores neurais a partir de células ES é baseado em embrióides corpo formação (EB), que revela a diferenciação das células de todas as camadas germinativas incluindo neuroectoderma. Um método alternativo e mais eficiente para induzir o desenvolvimento de células neuroepiteliais usa actividade indutora do estroma de células derivadas (SDIA), que pode ser alcançado pelas células de cultura co-ES com o osso do crânio derivadas da medula células do estroma (1). Tanto, a formação de EB e SDIA, revelam o desenvolvimento de rosette-como estruturas, que são pensados para assemelhar-se do tubo neural e / ou da crista neural, como progenitores. Os precursores neurais podem ser isoladas, expandidas e ainda mais diferenciado em neurônios e células gliais específicos usando condições de cultura definidas. Aqui, descrevemos a produção e isolamento de rosetas como em co-cultura experimentos com a linhagem de células do estroma MS5 (2-5).
Protocol
Passo 1
- Placa de mitomicina-C ggrowth inibido (10 mcg / ml para 2,5 horas) MS5 células a uma densidade de 70 mil / cm2 em gelatina-revestido (0,01% por 30 minutos) 6 pratos bem em α-MEM mídia.
- Quando as células são inscritos e formaram uma monocamada (sobre o crescimento noite), mude para SRM.
- Manualmente isolar colônias de células ES de culturas de células ES usando uma seringa com uma agulha de 27 ½ G.
- Tritrurate as colônias cuidadosamente com uma ponta de 1 ml azul e placa em baixa densidade na MS5 células (geralmente 2-3 colônias por 6 placa bem).
Nota: As células-tronco embrionárias também podem ser tomadas a partir de propagação enzimática utilizando colagenase ou tripsina.
Passo 2
- Cultivar as células ES na MS5 alimentadores de 14-21 dias até roseta contendo formam colônias.
Nota: Alterar mídia com freqüência. O rosetas são geralmente nas bordas exteriores das colônias e sua formação pode ser muito maior se Noggin 300-500 ng / ml é adicionado ao SRM (3). Em alguns protocolos de diferenciação, SRM podem ser trocados com N2-A mídia e completada com o crescimento ou outros fatores para promover a especificação de células (2-5).
Passo 3
- Isolar e escolher o rosetas com uma agulha de 27 ½ G sob um microscópio.
Nota: Evite cortar e escolher o MS5 células do estroma. Se colônias são embalados com rosetas, também se pode isolar a colônia inteira.
Passo 4
- Aspirar os clusters de rosetas, tritrurate-los cuidadosamente com uma ponta de 1 ml azul, e placa-los em poli-L-ornitina (0,001%) e fibronectina (1 mg / ml) ou laminina (1 mg / ml) revestido 6 poços em N2-A mídia geralmente suplementado com bFGF (20 ng / ml). O rosetas vai reformar e expandir.
Nota: Para aumentar a sobrevivência da célula, pode-se a placa de pequenos grupos em forma de gotas para aumentar a densidade de células. Esta etapa também pode ser modificada, completando o N2-A mídia com crescimento adicional ou outros fatores para promover a especificação de células (2-5).
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Discussion
Este protocolo demonstra as diferentes etapas na geração e isolamento de células gliais a partir de células embrionárias humanas usando SDIA. A aplicação deste método é múltiplo e tem sido usado em muitos protocolos para a produção de neurônios especificado (por exemplo, 1, 2, 5-9). O rosetas são pensadas para se parecer com as células do tubo neural com um fenótipo anterior (2, 5, 10) e também contêm progenitores da crista neural (11, 12). Além disso, eles mantêm um certo nível de plasticidade, uma vez que podem ser modelado por fatores específicos, em condições de cultura definidas. Assim, os progenitores SDIA derivados neural pode dar origem a muitos tipos de células do sistema nervoso central e periférico tornando-os uma ferramenta útil para a derivação de diferentes populações de células neurais de paradigmas diferenciação de células ES.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | ||
| alpha-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12571 | ||
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | ||
| Knockout-DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10829 | ||
| Knockout serum replacement | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | ||
| MEM nonessential amino acid solution | GIBCO, by Life Technologies | 12383 | ||
| DMEM/F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | ||
| N2-A supplement | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich | M0503 | ||
| Gelatine type-A | Sigma-Aldrich | G1890 | ||
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | 0.01% solution | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
| 1 mL Syringe with 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 309623 | ||
| N2-A media | medium | DMEM/F12 + 1% N2-A supplement | ||
| Serum replacement media (SRM) | medium | Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement +1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine | ||
| α-MEM media | medium | α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin | ||
| MS5 | cell line | stromal cells | ||
| Microscope | ||||
| 6-well Plates | for tissue culture |
References
- , Forthcoming.
