Summary
MTT法是一种简便，重现性好比色法测定细胞活力评价的基础上减少黄色的MTT和不溶于水，紫色的甲臜的生产。在这里，nanogenomedicine治疗后，MCF - 7细胞的可行性进行了评估。
Abstract
未来派nanogenomedicine（例如，短干扰RNA和反义）的细胞毒性，可能妨碍其临床发展。这些基因为基础的医药和/或它的载体可能会引起细胞毒性。对于评估等的细胞毒作用，常见的方法是在很大程度上依赖利用3 - （4,5 - 二甲基-2 - 噻唑基）-2，5 - 二苯基- 2H -四氮唑溴（MTT）法已被广泛用作比色的方法，在细胞线粒体脱氢酶的酶的活性的基础上。在当前的调查，MCF - 7细胞接种在96孔板和50％汇合，他们与不同的nanopolyplexes对待，并受到24小时后，以MTT法检测。水溶性的黄色的MTT代谢的代谢活跃的细胞，不溶于水的紫色的甲臜，这是进一步溶解在二甲基亚砜和Sornson的缓冲区pH值10.5。由此产生的产品是可以量化的使用酶标仪在570 nm处一个分光。
Protocol
MCF - 7播种在96孔板：
MCF - 7细胞分别培养在25吨的烧瓶中包含在37贝科的修改鹰的中等（DMEM），10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素，和100微克/毫升链霉素中等°彗星与5％的CO 2，95％空气和完整的湿度。一旦达到〜90％汇合，他们分离用0.05％胰蛋白酶/ EDTA，并通过台盼蓝和血球计数。这些细胞，然后悬浮在浓度为4 × 10 4细胞/厘米2，补充到96孔板，8道移液器（即250μL/） 。背景吸收，一些井依然无细胞，即作为空白对照。
治疗不同nanopolyplexes的细胞：
在40-50％汇合（48小时后播种），培养细胞治疗的纳米爆聚酰胺树枝状（即Superfect ®和Polyfect ®）和一种新型的测试聚合物后，转由供应商提供的指令。细胞也与表皮生长因子受体治疗和反义单独炒，并与这两个寡核苷酸的三个不同nanopolyplexes的聚合物（N = 4）。四口井仍然控制未经处理的。经过4个小时的治疗媒体被拆除，并与新媒体的补充。
MTT法检测细胞活力评价：
MTT法检测转染后24小时。为此，MTT溶液在PBS 1mg/ml的准备，并通过0.2微米的过滤器过滤。然后，每孔加入50μL的MTT加200μL无酚红的DMEM，无细胞的空白孔除外。细胞孵育4小时，在37℃，5％CO 2，95％的空气湿度和完整。 4小时后，MTT溶液和200μLDMSO和25μlSorenson的甘氨酸缓冲液（0.1M，0.1M的氯化钠，甘氨酸0.1氢氧化钠的pH值：10.5）所取代。板在室温下5分钟，继续培养和使用酶标仪在570 nm处的测试波长和参考波长630纳米一个井光密度（OD值）测定。
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Discussion
MTT法被认为是一个通用的方法，可以根据各种治疗方法的评估和相应的细胞的可行性。由此产生的甲臜的生产似乎是在细胞能量代谢水平成正比。因此，它是可能的措施，甚至在细胞增殖的情况下的代谢活性的细胞。产生的甲臜量在孵化介质的MTT量是成正比的。虽然，这是要求达到最高金额的甲臜的MTT浓度产生的可能发生变化后，利用不同的细胞系。此外，使用这种检测，可以检测到非常小的活细胞数和错误的发生率将微乎其微，因为没有需要洗涤步骤。甲臜的吸收随细胞数量以及pH值可以克服缓冲区此外，在pH 值 10.5 1。甲臜的颜色稳定，在常温下几个小时2。超过一盘的情况下，控制应包括在其他板块以及。然而，这种方法受到一些轻微缺点：一个）代谢不活跃细胞可以不被死细胞3，b歧视）MTT溶液应是由轻保护，即使它可能是在4 ° C存储最多之一一个月2，三）无法验证药物的稳定性，在中期和D）MTT法用于细胞不能被其后的任何其他实验使用。
应该引起酚红在570 nm处的吸收。此外，以前报道，酚红，具有雌激素活性，可能会影响细胞生长模式在一些雌激素的反应细胞，随后MTT结果不精确，。为了避免这种影响，我们利用4无酚红的DMEM。
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Acknowledgments
作者想承认干细胞技术和大不里士沙希德亚瓦尔公司分别提供DMEM培养液无酚红和无菌水注射作为礼物。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 t-flask | Orange Scientific | 5510100 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Penicillin 200,000 u/ml | CinnaGen | CR7913 | |
| Streptomycin 200 mg/ml | CinnaGen | CR7912 | |
| trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Superfect | Qiagen | 301105 | |
| Polyfect | Qiagen | 301305 | |
| EGFR antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| Scrambled antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| DMEM without phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 11880 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| hemocytometer | HBG | ||
| 8-channel pipette | TreffLab Transferpette | 96.9918.10.1 | |
| Disposable syringe filter | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 2052-025 | |
| Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters | BioTek | ELX808 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3860-096 | |
| Laminar flow hood | Esco Products | ||
| CO2 Incubator | ASTEC |
References
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH Dependence of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide-Formazan Absorption on Chemosensitivity Determined by a Novel Tetrazolium-based Assay. Cancer Research. 49, 4435-4435 (1989).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of Lmmunological Methods. 65, 55-55 (1983).
- Yang, M. Energy and Redox States in the C6 Glioma Cells Following Acute Exposure to Zn, Se +4 , and Se +6 and the Correlation with Apoptosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 16 (1), 13-13 (2006).
- Spinner, D. M. MTT Growth Assays in Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer: Methods and Protocols. Bartlett, J. M. S. , Humana Press, Inc. 175-177 (2000).
