Summary
MTT परख सेल व्यवहार्यता के मूल्यांकन के लिए एक आसान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वर्णमिति पीले MTT की कमी और पानी में अघुलनशील बैंगनी formazan के उत्पादन पर आधारित परख है. यहाँ nanogenomedicine के उपचार पर MCF-7 कोशिकाओं की व्यवहार्यता का मूल्यांकन किया गया है.
Abstract
भविष्य nanogenomedicine (उदाहरण के लिए, कम हस्तक्षेप शाही सेना और antisense) के cytotoxicity इसके नैदानिक विकास में बाधा हो सकती है. इनमें से, जीन आधारित चिकित्सा और / या अपने वाहक सेलुलर विषाक्तता बटोर सकता है. ऐसे cytotoxicity के आकलन के लिए, एक आम पद्धति 3 के उपयोग पर काफी हद तक निर्भर है - (4, 5 - डाइमिथाइल-2-thiazolyl) -2, 5 diphenyl-2H tetrazolium ब्रोमाइड (MTT) परख जो व्यापक रूप से किया गया है के रूप में इस्तेमाल किया एक वर्णमिति दृष्टिकोण कोशिकाओं में mitochondrial डिहाइड्रोजनेज एंजाइमों की गतिविधि के आधार पर. इस मौजूदा जांच में, MCF 7 कोशिकाओं 96 अच्छी तरह से थाली में inoculated थे और 50% confluency वे विभिन्न nanopolyplexes के साथ इलाज किया गया और के लिए 24 घंटे के बाद परख MTT अधीन है. जल में घुलनशील पीले MTT पानी अघुलनशील बैंगनी formazan, जो आगे dimethylsulfoxide और Sornson बफर 10.5 पीएच में भंग कर रहा है metabolically सक्रिय कोशिकाओं द्वारा metabolized है. परिणामी उत्पाद 570 एनएम पर एक प्लेट रीडर का उपयोग spectrophotometry द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है.
Protocol
MCF-7 बोने 96 अच्छी तरह से थाली में:
MCF - सात कक्षों 25 टी - कुप्पी में 37 पर है Dulbecco संशोधित है ईगल DMEM () मध्यम, 10% FBS, 100 / यू मिलीलीटर पेनिसिलिन, और 100 स्ट्रेप्टोमाइसिन / μg मिलीलीटर युक्त मध्यम में सुसंस्कृत थे ° सी 5% 2 सीओ, 95% के साथ हवा और पूरा नमी. एक बार ~ 90% तक पहुँच confluency, वे 0.05% trypsin EDTA / का उपयोग कर अलग थे और trypan नीले और hemocytometer के माध्यम से गिना. इन कोशिकाओं को फिर 4 के एक एकाग्रता × 4 कोशिकाओं 10 / 2 सेमी में resuspended थे और 96 अच्छी तरह से थाली पर एक 8 चैनल विंदुक द्वारा (यानी, 250 μl / अच्छी तरह से). पृष्ठभूमि अवशोषण के लिए, कुछ कुओं सेल मुक्त, यानी रिक्त नियंत्रण के रूप में बने रहे थे.
विभिन्न nanopolyplexes के साथ कोशिकाओं का इलाज:
40-50% confluency (48 घंटे पोस्ट बोने), खेती कोशिकाओं nanostructured starburst polyamidoamine dendrimers (यानी, Superfect ® और Polyfect ®) और एक उपन्यास परीक्षण अभिकर्मक आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान अनुदेश निम्नलिखित बहुलक के साथ इलाज किया गया. कक्ष भी EGFR के साथ इलाज किया गया और antisense अकेले तले हुए, और इन दो oligonucleotides के तीन अलग nanopolyplexes के साथ और पॉलिमर (n = 4) के साथ. चार कुओं नियंत्रण के रूप में इलाज बने रहे थे. 4 घंटे के बाद इलाज मीडिया हटा दिया गया और नए मीडिया के साथ मंगाया.
MTT परख सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए:
MTT परख अभिकर्मक के बाद 24 घंटे का प्रदर्शन किया गया था. इस प्रयोजन के लिए, MTT समाधान पीबीएस में 1mg/ml पर तैयार किया गया था और 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था. फिर, MTT प्लस phenol के लाल के बिना 200 DMEM के μl 50 μl प्रत्येक कुएं में जोड़े गए सेल मुक्त खाली कुओं को छोड़कर. कक्ष 4 घंटे के लिए 37 incubated रहे थे डिग्री सेल्सियस 5% 2 सीओ, 95% हवा और पूरा नमी के साथ . 4 घंटे के बाद, MTT समाधान हटा दिया था और DMSO और 25μl Sorenson ग्लाइसिन बफर (ग्लाइसिन 0.1M, NaCl 0.1M, पीएच: 0.1 NaOH के साथ 10.5) 200 μl के साथ बदल दिया. थाली आगे कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए incubated था, और कुओं के ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) 570 एनएम के एक परीक्षण तरंग दैर्ध्य है और 630 एनएम के संदर्भ तरंगदैर्ध्य पर एक प्लेट रीडर का उपयोग करके निर्धारित किया गया था.
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Discussion
MTT परख के लिए एक बहुमुखी विधि समझा जाता है और तदनुसार कोशिकाओं की व्यवहार्यता विभिन्न उपचार पर मूल्यांकन किया जा सकता है. परिणामी formazan के उत्पादन के लिए कोशिकाओं में ऊर्जा चयापचय के स्तर के लिए आनुपातिक प्रतीत होता है. इसलिए, यह संभव है सेल प्रसार के अभाव में भी metabolically सक्रिय कोशिकाओं को मापने. formazan की राशि का उत्पादन ऊष्मायन माध्यम MTT की राशि के लिए आनुपातिक है. जबकि, MTT की एकाग्रता जो formazan की अधिकतम राशि प्राप्त करने की आवश्यकता है विभिन्न सेल लाइनों के उपयोग पर बदल सकता है का उत्पादन किया. इसके अलावा, इस परख इस्तेमाल, जीवित कोशिकाओं की बहुत छोटी संख्या और पता लगाया जा सकता है त्रुटियों की घटनाओं को कम होने के बाद से वहाँ कदम धोने के लिए कोई जरूरत नहीं है. formazan के अवशोषण सेल संख्या के रूप में अच्छी तरह के रूप में पीएच जो में 10.5 पीएच एक बफर के अलावा के साथ दूर किया जा सकता है के साथ बदलता रहता है. formazan का रंग कमरा 2 के तापमान पर कुछ घंटों के लिए स्थिर है . एक से अधिक प्लेट के मामले में, नियंत्रण अन्य प्लेटों में शामिल किया जाना चाहिए के रूप में अच्छी तरह से. फिर भी, इस विधि को कुछ मामूली नुकसान से ग्रस्त है: एक) metabolically निष्क्रिय कोशिकाओं मृत 3 कोशिकाओं, ख के साथ जा नहीं भेदभाव कर सकते हैं) MTT समाधान प्रकाश से संरक्षित हो चाहिए भले ही यह एक 2 महीने की अधिकतम के लिए 4 ° सी पर संग्रहीत हो सकता है, ग) यह मध्यम में दवा की स्थिरता को मान्य करने के लिए विफल रहता है, और घ) MTT के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं बाद में किसी भी अन्य assays के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है.
यह पैदा हो सकता है कि phenol लाल 570 एनएम पर अवशोषण चाहिए. इसके अलावा, यह पहले से सूचित किया गया है कि phenol लाल एस्ट्रोजन गतिविधि के पास जो कुछ एस्ट्रोजन उत्तरदायी कोशिकाओं, imprecise MTT परिणाम आगामी के भीतर सेल के विकास पैटर्न को प्रभावित कर सकता है. इस तरह के प्रभाव से बचने के के लिए, हम DMEM phenol 4 लाल के बिना उपयोग किया है.
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Acknowledgments
लेखकों के लिए तोहफे के रूप में इंजेक्शन के लिए phenol लाल और बाँझ पानी के बिना DMEM प्रदान करने के लिए स्टेम सेल प्रौद्योगिकी और शाहिद गाजी Tabriz कंपनियों क्रमशः स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 t-flask | Orange Scientific | 5510100 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Penicillin 200,000 u/ml | CinnaGen | CR7913 | |
| Streptomycin 200 mg/ml | CinnaGen | CR7912 | |
| trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Superfect | Qiagen | 301105 | |
| Polyfect | Qiagen | 301305 | |
| EGFR antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| Scrambled antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| DMEM without phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 11880 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| hemocytometer | HBG | ||
| 8-channel pipette | TreffLab Transferpette | 96.9918.10.1 | |
| Disposable syringe filter | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 2052-025 | |
| Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters | BioTek | ELX808 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3860-096 | |
| Laminar flow hood | Esco Products | ||
| CO2 Incubator | ASTEC |
References
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH Dependence of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide-Formazan Absorption on Chemosensitivity Determined by a Novel Tetrazolium-based Assay. Cancer Research. 49, 4435-4435 (1989).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of Lmmunological Methods. 65, 55-55 (1983).
- Yang, M. Energy and Redox States in the C6 Glioma Cells Following Acute Exposure to Zn, Se +4 , and Se +6 and the Correlation with Apoptosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 16 (1), 13-13 (2006).
- Spinner, D. M. MTT Growth Assays in Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer: Methods and Protocols. Bartlett, J. M. S. , Humana Press, Inc. 175-177 (2000).
