Summary
MTTアッセイは、水不溶性の紫色ホルマザンの黄色のMTTと生産の減少に基づいて細胞生存率の評価のための簡単かつ再現可能な比色アッセイである。ここでは、nanogenomedicineの治療時にMCF - 7細胞の生存率が評価されています。
Abstract
未来nanogenomedicine（例えば、短干渉RNAおよびアンチセンス）の細胞毒性は、臨床開発を妨げる可能性があります。これらのうち、遺伝子ベースの医学および/またはそのキャリアは、細胞毒性を誘発し得る。このような細胞毒性の評価のために、一般的な方法論は、3の利用率に大きく依存します - として広く使用されている（4,5 - ジメチル-2 - チアゾリル）-2、5 - ジフェニル- 2H -テトラゾリウムブロマイド（MTT）アッセイ細胞内のミトコンドリアのデヒドロゲナーゼの酵素の活性に基づいて比色分析的なアプローチ。この現在の調査では、MCF - 7細胞を96ウェルプレートにし、50％コンフルエントで接種された彼らは、24時間後に別のnanopolyplexesで処理し、MTTアッセイを行った。水溶性黄色のMTTは、さらにジメチルスルホキシドとSornsonの緩衝液pH 10.5に溶解して水不溶性の紫色ホルマザンへの代謝活性を有する細胞で代謝される。得られた生成物は、570nmでプレートリーダーを用いて分光光度法により定量することができる。
Protocol
MCF - 7を96ウェルプレートに播種。
MCF - 7細胞は、37ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、10％FBS、100 U / mlペニシリン、および100μg/ mlのストレプトマイシンを含む培地中で25 T -フラスコで培養し、℃、5％CO 2、95％空気と完全な湿度。一度〜90％コンフルエントに達した、彼らを0.05％トリプシン/ EDTAを用いて分離し、トリパンブルーや血球計算盤により計数した。これらの細胞を4 × 10 4細胞/ cm 2で再懸濁し、8チャンネルピ ペットで（すなわち、250μl/ウェル）を96ウェルプレートに追加されました。バックグラウンド吸収のために、いくつかのウェルはブランクコントロールとして無細胞、すなわちままであった。
異なるnanopolyplexesで細胞を処理する：
コンフルエント40から50パーセント（48時間後播種）で、培養細胞は、ナノ構造のスターバーストポリアミドアミンデンドリマー（すなわち、Superfect ®およびPolyfect ®）と供給業者から提供されたトランスフェクションの命令に続く新たなテストのポリマーで処理した。細胞はまた、EGFRで処理し、一人でアンチセンスをスクランブルされ、そしてこれら2つのオリゴヌクレオチドの3つの異なるnanopolyplexesと、ポリマー（n = 4）を持つ。 4つのウェルはコントロールとして未処理のままであった。 4時間後に治療の媒体を除去し、新鮮な培地を補充。
細胞の生存率を評価するためのMTTアッセイ：
MTTアッセイは、トランスフェクションの24時間後に行った。この目的のために、MTT溶液をPBSで1mg/mlに調製し、0.2μmのフィルターで濾過した。その後、MTTを加えたフェノールレッドを含まないDMEM200μlを50μlの無細胞ブランクウェルを除き、各ウェルに加えた。細胞は37℃で4時間インキュベートした℃、5％CO 2、95％空気と完全な湿度。 4時間後、MTT溶液を除去し、DMSOおよび25μlのソレンソンのグリシンバッファー（グリシン0.1MのNaCl 0.1M、pH値：10.5 0.1 NaOHで）200μlで置き換えられました。プレートは、さらに室温で5分間インキュベートし、井戸の光学密度（OD）を570nmのテストの波長と630nmの基準波長でプレートリーダーを用いて決定した。
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Discussion
MTTアッセイは、汎用的な方法とみなされ、それに応じて細胞の生存率は、様々な治療法により評価することができた。結果ホルマザンの産生は細胞内のエネルギー代謝のレベルに比例するように見えます。したがって、それも細胞増殖がない場合に代謝的に活性化された細胞を測定することが可能です。生成されたホルマザンの量は、培養培地中のMTTの量に比例する。一方で、生産ホルマザンの最大量を達成するために必要とされるMTTの濃度は、異なる細胞株の利用によって変更される可能性があります。また、このアッセイを使用したこと、生きている細胞の非常に小さな数を検出することができたと手順を洗浄するための必要がないため、エラーの発生率は最小限になります。ホルマザンの吸収は、細胞数だけでなく、pHが10.5 1における緩衝液の添加で克服できるのpHによって異なります。ホルマザンの色は、室温2で数時間安定です。複数のプレートの場合には、コントロールは、他のプレートに含まれるべきです。しかし、この方法はいくつかのマイナーな欠点から苦しむ：）代謝的に不活性な細胞は死細胞3、bで判別できない）、それが一ヶ月2の最大値は4℃で保存することができるにもかかわらず、MTT溶液は、光から保護されるべきであるC）それは、培地中に薬剤の安定性を検証するために失敗し、MTTのために使用されるd）細胞は、その後、他のアッセイに使用することはできません。
それは、フェノールレッドは570nmで吸収することが喚起されるべきである。さらに、それは、以前はフェノールレッドは、不正確なMTTの結果をその後、いくつかのエストロゲン応答性細胞内の細胞の成長パターンに影響を及ぼす可能性のあるエストロゲン活性を有していることが報告されている。そのような影響を避けるために、我々は、フェノールレッド4を含まないDMEMを用いている。
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Acknowledgments
著者らは、贈り物として注射用フェノールレッドおよび滅菌水を含まないDMEMを提供するため、それぞれの幹細胞技術とシャヒガジタブリーズの企業に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 t-flask | Orange Scientific | 5510100 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Penicillin 200,000 u/ml | CinnaGen | CR7913 | |
| Streptomycin 200 mg/ml | CinnaGen | CR7912 | |
| trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Superfect | Qiagen | 301105 | |
| Polyfect | Qiagen | 301305 | |
| EGFR antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| Scrambled antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| DMEM without phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 11880 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| hemocytometer | HBG | ||
| 8-channel pipette | TreffLab Transferpette | 96.9918.10.1 | |
| Disposable syringe filter | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 2052-025 | |
| Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters | BioTek | ELX808 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3860-096 | |
| Laminar flow hood | Esco Products | ||
| CO2 Incubator | ASTEC |
References
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH Dependence of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide-Formazan Absorption on Chemosensitivity Determined by a Novel Tetrazolium-based Assay. Cancer Research. 49, 4435-4435 (1989).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of Lmmunological Methods. 65, 55-55 (1983).
- Yang, M. Energy and Redox States in the C6 Glioma Cells Following Acute Exposure to Zn, Se +4 , and Se +6 and the Correlation with Apoptosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 16 (1), 13-13 (2006).
- Spinner, D. M. MTT Growth Assays in Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer: Methods and Protocols. Bartlett, J. M. S. , Humana Press, Inc. 175-177 (2000).
