Summary
MTT 분석은 노란색 MTT의 감소와 물 불용성 보라색 formazan의 생산을 기반으로 세포 생존 능력 평가를위한 간단하고 재현성 colorimetric 분석이다. 여기 nanogenomedicine 치료시 MCF - 7 세포의 생존 능력이 평가되었습니다.
Abstract
미래 nanogenomedicine (예, 짧은 간섭 RNA와 안티 센스)의 세포 독성은 임상 개발을 방해 수 있습니다. 이들 중, 유전자 기반의 의학 및 / 또는 이동 통신사에서 세포 독성을 이끌어 수 있습니다. 이러한 세포 독성 평가를위한 일반적인 방법론 3의 활용에 따라 크게 좌우된다 - (4, 5 - 디메틸 - 2 - thiazolyl) 널리 사용되었습니다 -2, 5 - 디페닐 - 2 시간 - tetrazolium 브로마이드 (MTT) 분석 세포 mitochondrial 탈수소 효소의 활동을 기반으로하는 colorimetric 접근. 이 현재 조사에서, MCF - 7 세포는 96 - 웰 플레이트에 주사했다 50 % confluency에서 그들은 서로 다른 nanopolyplexes 대우했다, 24 시간 후 MTT 분석을 들어서는. 수용성 황색 MTT는 더욱 dimethylsulfoxide 및 Sornson의 버퍼 산도 10.5에 녹아있는 물에 불용성 보라색 formazan에 metabolically 활성 세포에 의해 대사됩니다. 결과 제품은 570 nm의에서 플레이트 판독기를 사용하여 분광 광도법으로 계량하실 수 있습니다.
Protocol
96 - 웰 플레이트에 MCF - 7 시딩 :
MCF - 7 세포는 37 Dulbecco의 수정된 이글의 중간 (DMEM) 10 % FBS, 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신을 포함하는 배지에서 25 T - 플라스크에 교양되었습니다 ° C 5% CO 2, 95 %를 공기와 습기 완료. 일단 ~ 90 % confluency에 도달, 그들은 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 사용하여 분리하고 trypan 파란색과 hemocytometer에 의해 계산되었다. 이러한 전지는 다음 4 농도 × 10 4 세포 / cm 2 resuspended 및 8 채널 피펫으로 (즉, 250 μl / 음) 96 - 웰 플레이트에 추가되었습니다. 배경 흡수 들어, 일부 우물은 빈 제어로 휴대가없는, 즉 남아 있었다.
다른 nanopolyplexes와 세포 치료 :
40-50%에서 (48 시간 이후에 씨를 뿌린다) confluency, 재배 전지 nanostructured 스타 버스트 polyamidoamine의 dendrimers (즉, Superfect ® 및 Polyfect ®)와 공급자가 제공한 transfection 지침에 따라 새로운 테스트 폴리머로 치료했다. 세포는 또한 EGFR 대우 혼자 안티 센스를 스크램블하고,이 두 oligonucleotides의 세 가지 nanopolyplexes과 고분자 (n은 = 4)되었습니다. 푸르 웰스는 제어로 치료 남아 있었다. 사시간 후 치료 미디어가 제거되었습니다 신선한 미디어 보충함.
세포 생존 능력을 평가하기위한 MTT 분석 :
MTT 분석은 transfection 후 24 시간을 수행했다. 이러한 목적으로, MTT 솔루션은 PBS에 1mg/ml에서 준비되었으며 0.2 μm의 필터를 통해 필터링했습니다. 그런 다음, MTT 플러스 페놀 레드없는 DMEM 200 μl 50 μl은 세포가없는 빈 우물 제외하고, 각 우물에 추가되었습니다. 전지는 37 4 시간 동안 incubated되었습니다 ° C 5% CO 2, 95 %의 공기와 완벽한 습도. 사시간 후, MTT 솔루션은 제거하고 DMSO와 25μl 소렌손의 글리신 버퍼 (글리신 0.1M, 0.1M NaCl, 전화 : 10.5 0.1 NaOH)를 200 μl로 대체되었습니다. 접시는 더욱 실온에서 5 분 incubated되었고, 우물의 광학 밀도 (OD)는 570 nm의의 테스트 파장과 630 nm의의 기준 파장에서 플레이트 판독기를 사용하여 결정되었다.
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Discussion
MTT 분석은 다양한 방법으로 간주하고 이에 따라 세포의 생존은 다양한 치료시 평가 수 있습니다. 결과 formazan의 생산은 세포의 에너지 대사의 수준에 비례하는 것 같아요. 따라서도 세포 증식의 부재에 metabolically 활성 세포를 측정할 수 있습니다. 생산 formazan의 양은 배양 매체에서 MTT의 금액에 비례합니다. 동안 formazan의 최대 금액을 달성하는 데 필요한 MTT의 농도는 다른 세포 라인의 활용도에 따라 변경될 수 있습니다를 생산. 게다가,이 분석을 사용하는 데, 살아있는 세포의 매우 작은 번호가 감지 될 수 있으며, 세척 단계를 필요가 없기 때문에 오류의 발병률은 최소한의 것입니다. formazan의 흡수는 pH의 10.5 1 버퍼를 추가로 극복할 수있는 핸드폰 번호뿐만 아니라 산도에 따라 다릅니다. formazan의 색상은 상온 2 몇 시간 동안 안정합니다. 하나 이상의 접시의 경우에는 컨트롤뿐만 아니라 다른 접시에 포함되어야합니다. 그럼에도 불구하고,이 방법은 몇 가지 사소한 단점을 앓고 :) metabolically 비활성 세포는 죽은 세포 3 B와 차별하실 수 없습니다)는 한 달 최대 4 ° C에 저장된 수있는 경우에도 MTT 솔루션, 빛으로부터 보호되어야 C) 그것은 매체 약물의 안정성을 검증하는 데 실패하고, D) MTT에 사용되는 전지는 이후 다른 assays에 대해 사용할 수 없습니다.
이것은 페놀 레드 570 nm의 흡수에 해당 evoked해야합니다. 또한, 그것은 이전에 페놀 레드 이란게 부정 확한 MTT 결과를 다음의 몇 가지 에스 트로겐 반응 세포 내의 세포 성장 패턴에 영향을 미칠 수있는 에스 트로겐의 활동을 가지고보고되었습니다. 이러한 영향을 방지하기 위해, 우리는 페놀 레드 넷없이 DMEM을 이용했습니다.
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Acknowledgments
저자는 선물로 주입에 대한 페놀 빨간색과 멸균 물없이 DMEM을 제공하는 각각 줄기 세포 기술과 샤히드 Ghazi 타브 리즈 회사를 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 t-flask | Orange Scientific | 5510100 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Penicillin 200,000 u/ml | CinnaGen | CR7913 | |
| Streptomycin 200 mg/ml | CinnaGen | CR7912 | |
| trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Superfect | Qiagen | 301105 | |
| Polyfect | Qiagen | 301305 | |
| EGFR antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| Scrambled antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| DMEM without phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 11880 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| hemocytometer | HBG | ||
| 8-channel pipette | TreffLab Transferpette | 96.9918.10.1 | |
| Disposable syringe filter | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 2052-025 | |
| Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters | BioTek | ELX808 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3860-096 | |
| Laminar flow hood | Esco Products | ||
| CO2 Incubator | ASTEC |
References
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH Dependence of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide-Formazan Absorption on Chemosensitivity Determined by a Novel Tetrazolium-based Assay. Cancer Research. 49, 4435-4435 (1989).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of Lmmunological Methods. 65, 55-55 (1983).
- Yang, M. Energy and Redox States in the C6 Glioma Cells Following Acute Exposure to Zn, Se +4 , and Se +6 and the Correlation with Apoptosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 16 (1), 13-13 (2006).
- Spinner, D. M. MTT Growth Assays in Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer: Methods and Protocols. Bartlett, J. M. S. , Humana Press, Inc. 175-177 (2000).
