Summary
O MTT é um ensaio simples e reprodutível colorimétrico para avaliação de viabilidade celular com base na redução do MTT amarelo e produção de formazan insolúvel em água roxa. Aqui, a viabilidade de células MCF-7 sobre o tratamento de nanogenomedicine foi avaliada.
Abstract
Citotoxicidade da nanogenomedicine futurista (eg, curtas de RNA interferente e antisense) pode prejudicar o seu desenvolvimento clínico. Desses, o medicamento baseadas em genes e / ou seu portador pode provocar toxicidade celular. Para avaliação de citotoxicidade, uma metodologia comum é em grande parte dependente de utilização de 3 - (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2, 5-difenil-2H-tetrazolium brometo de ensaio (MTT), que tem sido amplamente utilizado como uma abordagem colorimétrico baseado na atividade das enzimas desidrogenase mitocondrial nas células. Na presente investigação, MCF-7 foram inoculadas em células de 96 poços da placa e em 50% confluência foram tratados com nanopolyplexes diferentes e submetidos a ensaio de MTT após 24 horas. MTT solúvel em água amarela é metabolizado pelas células metabolicamente ativas para o formazan insolúvel em água roxa, que é mais dissolvido em dimetilsulfóxido pH e Sornson s tampão 10.5. O produto resultante pode ser quantificado por espectrofotometria utilizando um leitor de placas a 570 nm.
Protocol
MCF-7 semeadura em 96 poços da placa:
MCF-7 células foram cultivadas em 25 t frasco em meio contendo Médio Modified Dulbecco Águia (DMEM), 10% FBS, 100 U / ml de penicilina e 100 estreptomicina mcg / ml a 37 ° C com 5% de CO 2, 95% ar e umidade completa. Uma vez alcançada a 90% confluência, eles foram destacados utilizando 0,05% de tripsina / EDTA e contadas por meio de azul de tripano e hemocitômetro. Essas células foram então ressuspendidas a uma concentração de 4 × 10 4 células / cm 2 e depois acrescentada a placa de 96 poços (ou seja, 250 mL / poço) por uma pipeta de 8 canais. Para a absorção de fundo, alguns poços foram permaneceu livre de células, ou seja, como controle em branco.
Tratamento de células com nanopolyplexes diferentes:
Na confluência de 40-50% (48 horas após a semeadura), as células cultivadas foram tratadas com dendrímeros starburst nanoestruturados poliamidoamina (ie, Superfect ® e Polyfect ®) e um polímero novo teste seguindo as instruções fornecidas pelo fornecedor de transfecção. Células também foram tratados com EGFR e mexidos antisense sozinho, e com os três nanopolyplexes diferentes destes dois oligonucleotídeos e com polímeros (n = 4). Quatro poços foram permaneceram sem tratamento como controle. Após 4 horas de tratamento da mídia foram removidos e repostos com a mídia fresco.
MTT ensaio para avaliar a viabilidade das células:
MTT foi realizada 24 horas após transfecção. Para este fim, a solução de MTT foi preparado em 1mg/ml em PBS e foi filtrado por um filtro de 0,2 mm. Então, 50 ul de MTT mais 200 mL de DMEM sem vermelho de fenol foram adicionados em cada poço, com exceção dos poços sem células em branco. Células foram incubadas durante 4 horas a 37 ° C com 5% de CO 2, 95% de ar e umidade completa. Após 4 horas, a solução MTT foi removido e substituído com 200 mL de DMSO e 25μl de Sorenson tampão glicina (glicina 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH: 10,5 com 0,1 NaOH). A placa foi novamente incubada por 5 min à temperatura ambiente, ea densidade óptica (DO) dos poços foi determinada utilizando um leitor de placas em um teste de comprimento de onda de 570 nm e um comprimento de onda de referência de 630 nm.
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Discussion
O ensaio de MTT é considerado um método versátil e, consequentemente, a viabilidade das células poderia ser avaliada após vários tratamentos. A produção de formazan resultante parece ser proporcional ao nível do metabolismo energético nas células. Portanto, é possível medir as células metabolicamente ativados, mesmo na ausência de proliferação celular. A quantidade de formazan produzido é proporcional à quantidade de MTT no meio de incubação. Enquanto, a concentração de MTT que é necessário para alcançar quantidade máxima de formazan produzido pode mudar após a utilização de linhas de células diferentes. Além disso, ter usado este ensaio, número muito pequeno de células vivas podem ser detectados e a incidência de erros é mínima, pois não há necessidade de etapas de lavagem. A absorção de formazan varia de acordo com o número de células, bem como pH que poderia ser superado com adição de tampão em pH 10.5 1. A cor do formazan é estável por algumas horas em temperatura ambiente 2. No caso de mais de uma placa, os controles devem ser incluídos em outras placas também. No entanto, este método sofre algumas desvantagens menores: a) células metabolicamente inativas não pode ser discriminado com células mortas 3, b) solução de MTT deve ser protegido da luz, mesmo que pudesse ser armazenado a 4 ° C para um máximo de um mês 2, c) ele não consegue validar estabilidade do fármaco no meio, e d) células utilizadas para MTT não pode ser posteriormente utilizado para qualquer outros ensaios.
Ele deve ser evocado que o vermelho de fenol absorve a 570 nm. Além disso, tem sido relatado que o vermelho de fenol possui atividade estrogênica, que pode afetar o padrão de crescimento de células dentro de algumas células estrogênio sensível, que se seguiu MTT resultados imprecisos. Para evitar esse impacto, temos utilizado DMEM sem vermelho de fenol 4.
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Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Tecnologia de Células-Tronco e empresas Shahid Ghazi Tabriz, respectivamente, para a prestação de DMEM sem água vermelha e estéril para injeção de fenol como presentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 t-flask | Orange Scientific | 5510100 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Penicillin 200,000 u/ml | CinnaGen | CR7913 | |
| Streptomycin 200 mg/ml | CinnaGen | CR7912 | |
| trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Superfect | Qiagen | 301105 | |
| Polyfect | Qiagen | 301305 | |
| EGFR antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| Scrambled antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| DMEM without phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 11880 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| hemocytometer | HBG | ||
| 8-channel pipette | TreffLab Transferpette | 96.9918.10.1 | |
| Disposable syringe filter | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 2052-025 | |
| Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters | BioTek | ELX808 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3860-096 | |
| Laminar flow hood | Esco Products | ||
| CO2 Incubator | ASTEC |
References
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH Dependence of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide-Formazan Absorption on Chemosensitivity Determined by a Novel Tetrazolium-based Assay. Cancer Research. 49, 4435-4435 (1989).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of Lmmunological Methods. 65, 55-55 (1983).
- Yang, M. Energy and Redox States in the C6 Glioma Cells Following Acute Exposure to Zn, Se +4 , and Se +6 and the Correlation with Apoptosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 16 (1), 13-13 (2006).
- Spinner, D. M. MTT Growth Assays in Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer: Methods and Protocols. Bartlett, J. M. S. , Humana Press, Inc. 175-177 (2000).
