Summary
MTT-analysen är en enkel och reproducerbar kolorimetriska analys för utvärdering av cellviabiliteten bygger på reduktion av gula MTT och produktion av vatten olösliga lila formazanförening. Här har livskraft MCF-7 celler vid behandling av nanogenomedicine utvärderats.
Abstract
Cytotoxicitet av den futuristiska nanogenomedicine (t.ex. korta störande RNA och antisens) kan hämma den kliniska utvecklingen. Av dessa kan genbaserade medicin och / eller dess bärare framkalla cellulära toxicitet. För bedömning av sådana cytotoxicitet, är en gemensam metod till stor del beroende på användning av 3 - (4, 5-Dimetyl-2-tiazolyl) -2, 5-difenyl-2H-tetrazolium bromid (MTT) analys som har använts i stor omfattning som en kolorimetrisk synsätt som bygger på aktiviteten av mitokondriell dehydrogenas enzymer i celler. I det här aktuella undersökningen var MCF-7 celler inokuleras i 96-brunnars platta och 50% confluency de behandlades med olika nanopolyplexes och utsätts för MTT analys efter 24 timmar. Vattenlöslig gula MTT metaboliseras av metaboliskt aktiva celler till vatten olösliga lila formazanförening, vilket ytterligare löses i dimetylsulfoxid och Sornson buffert pH 10,5. Den resulterande produkten kan kvantifieras med spektrofotometri på en platta läsare vid 570 nm.
Protocol
MCF-7 sådd i 96-brunnar:
MCF-7 celler odlades i 25 t-kolven i ett medium som innehåller Dulbecco ändrade Eagles medium (DMEM), 10% FBS, 100 U / ml penicillin, och 100 mikrogram / ml streptomycin vid 37 ° C med 5% CO 2, 95% luft och kompletta luftfuktighet. När nått ~ 90% confluency, de var fristående med 0,05% trypsin / EDTA och räknade med hjälp av trypan blått och hemocytometer. Dessa celler har sedan återsuspenderade vid en koncentration på 4 × 10 4 celler / cm 2 och läggas in på 96-brunnar (dvs 250 l / brunn) med en 8-kanals pipett. För bakgrund absorption, var några brunnar förblev cellfria, dvs som blankprov.
Att behandla celler med olika nanopolyplexes:
Vid 40-50% confluency (48 timmar efter sådd) var den odlade celler som behandlats med nanostrukturerade dendrimererna starburst polyamidoamine (dvs Superfect ® och Polyfect ®) och en roman testa polymer efter transfektion instruktion från leverantören. Celler behandlades också med EGFR-och äggröra antisens ensam, och med de tre olika nanopolyplexes av dessa två oligonukleotider och med polymerer (n = 4). Fyra brunnar förblev obehandlade kontroll. Efter 4 timmars behandling media togs bort och fylls på med nya medier.
MTT test för att utvärdera cellviabiliteten:
MTT-analysen utfördes 24 timmar efter transfektion. För detta ändamål har MTT lösning som beretts på 1mg/ml i PBS och var filtreras genom ett 0,2 ìm filter. Då var 50 l av MTT plus 200 ìl DMEM utan fenolrött läggas i varje brunn, utom cellfria tom brunnar. Cellerna inkuberades i 4 timmar vid 37 ° C med 5% CO 2, 95% luft och fullständig luftfuktighet. Efter 4 timmar var MTT lösningen bort och ersättas med 200 l av DMSO och 25μl Sörensons glycin buffert (glycin 0,1 miljoner, NaCl 0,1 miljoner, pH: 10,5 med 0,1 NaOH). Plattan ytterligare inkuberas i 5 minuter i rumstemperatur, och den optiska densitet (OD) av brunnarna bestämdes med hjälp av en tallrik läsare på ett test våglängd på 570 nm och en referens våglängd på 630 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MTT-analysen anses vara en mångsidig metod och därmed lönsamheten för de celler kan utvärderas på olika behandlingar. Produktionen av resulterande formazanförening verkar stå i proportion till graden av energiomsättningen i cellerna. Därför är det möjligt att mäta metaboliskt aktiverade celler även i frånvaro av cellproliferation. Mängden formazanföreningen produceras är proportionell mot mängden MTT i inkubationstiden mediet. Medan producerade koncentrationen av MTT som krävs för att uppnå maximalt formazanförening kan förändras vid användning av olika cellinjer. Dessutom att ha använt denna analys, kan mycket litet antal levande celler kan upptäckas och förekomsten av fel skulle vara minimal eftersom det inte finns något behov av tvätt steg. Absorptionen av formazanförening varierar med mobilnummer samt pH som kan övervinnas med tillsats av buffert vid pH 10,5 1. Färgen på formazanföreningen är stabil under några timmar i rumstemperatur 2. Vid mer än en tallrik, bör kontroller ingå i andra plattor också. Ändå lider den här metoden från några mindre nackdelar: a) metaboliskt inaktiva celler kan inte diskrimineras med döda celler 3, b) MTT-lösning ska skyddas från ljus, även om det kan lagras vid 4 ° C i högst en månad 2 c) den inte validera drog stabilitet på medellång och d) celler som används för MTT inte senare kan användas för något annat analyser.
Det bör framkallas som fenolrött absorberar vid 570 nm. Vidare har det tidigare rapporterats att fenolrött besitter östrogen aktivitet som kan påverka mönstret celltillväxt inom några östrogen lyhörd celler, och som grundar oprecisa MTT resultat. För att undvika sådana effekter har vi utnyttjat DMEM utan fenolrött 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för teknik stamceller och Shahid Ghazi Tabriz företag respektive för att ge DMEM utan fenol rött och sterilt vatten för injektion som gåvor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 t-flask | Orange Scientific | 5510100 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Penicillin 200,000 u/ml | CinnaGen | CR7913 | |
| Streptomycin 200 mg/ml | CinnaGen | CR7912 | |
| trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Superfect | Qiagen | 301105 | |
| Polyfect | Qiagen | 301305 | |
| EGFR antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| Scrambled antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| DMEM without phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 11880 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| hemocytometer | HBG | ||
| 8-channel pipette | TreffLab Transferpette | 96.9918.10.1 | |
| Disposable syringe filter | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 2052-025 | |
| Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters | BioTek | ELX808 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3860-096 | |
| Laminar flow hood | Esco Products | ||
| CO2 Incubator | ASTEC |
References
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH Dependence of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide-Formazan Absorption on Chemosensitivity Determined by a Novel Tetrazolium-based Assay. Cancer Research. 49, 4435-4435 (1989).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of Lmmunological Methods. 65, 55-55 (1983).
- Yang, M. Energy and Redox States in the C6 Glioma Cells Following Acute Exposure to Zn, Se +4 , and Se +6 and the Correlation with Apoptosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 16 (1), 13-13 (2006).
- Spinner, D. M. MTT Growth Assays in Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer: Methods and Protocols. Bartlett, J. M. S. , Humana Press, Inc. 175-177 (2000).
