Summary
我们描述了一个修改的辛
Abstract
高通量表达分析技术提供给科学家溢出的表达谱，但他们在组织特异性表达的决议，是因为在剖析个别组织的问题有限。表达数据需要进一步证实，表达用原位杂交，采用的技术，例如本地化细胞特异性mRNA的表达模式与补充。 原位杂交方法是费力，费时，往往需要广泛的优化取决于物种和组织。 原位实验木本物种，如针叶树挪威云杉（云杉冷杉）执行比较困难。在这里， 我们目前在修改后的辛原位杂交协议，这是快速，适用的植物种类广泛 ，包括体育冷杉 。短短几年的调整，包括改变的核糖核酸酶治疗和蛋白酶K的浓度，我们可以使用该协议的研究组织特异性表达的同源基因在男性生殖器官之一裸子植物和两个被子植物 ; P。 冷杉属，拟南芥和甘蓝型油菜 。该协议工作同样适用物种和基因研究。AtAP3和BnAP3螺纹A 中的第二个和第三个花器官观察拟南芥和 B。 油菜和DAL13 P.雄球花microsporophylls 冷杉 。 为 P 冷杉蛋白酶K的浓度，用于permeablize组织，必须增加至3克/毫升，而不是1克/毫升，可能是由于更紧凑的组织和更高水平的酚类物质和多糖。所有种类的核糖核酸酶治疗被删除，由于没有相应增加特异性信号强度降低。通过比较同源基因的组织特异性表达模式，从开花植物和针叶树，我们证明了DIG原位协议提出，只有分钟的调整，可应用于广泛的植物物种。因此，这个协议避免了双方广泛的物种特定的优化和赞成DIG标记的探针的放射性标记的探针费力的使用。我们已经选择了，说明在我们的电影协议的技术要求高的步骤。
高本汉安娜和珍妮卡尔松同等贡献这项研究。
通讯作者：安娜Anna.Karlgren @ ebc.uu.se和Jens楼松德斯特伦Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se高本汉
Protocol
这在非放射性的mRNA原位杂交协议是挪威云杉组织进行了优化，并详细描述。它是基于拟南芥/ 原位杂交油菜在我们的团体，而这又是基于迈耶罗维茨和爱尔兰实验室的协议，其中包括 1-4周慧敏爱尔兰，辛迪林肯和杰夫的优化优化的协议。
程序
1。固定和嵌入
要提供RNA保留组织需要迷恋和嵌入蜡前进行实地实验。固定和嵌入是关键的一步，因为不好固定材料可能会低或检测不到信号，即使mRNA的是非常丰富的。组织脱水，清除和嵌入式蜡在逐渐变化，以避免组织损伤。为了进一步避免的0.85％，氯化钠添加到第一次在挪威云杉组织脱水乙醇步骤细胞的收缩和肿胀。离开乙醇氯化钠（例如，它是在拟南芥/油菜籽协议），它是可能的。嵌入过程中的脱水步骤可在冰上进行RNase活性保持在最低或在4 ° C。在这个协议中的4％的多聚甲醛修复溶液中含有0.25％的戊二醛，这是应该给予更好的RNA保留，即使有些人认为，它可能没有什么区别（例如，它是在拟南芥/油菜籽协议）。最有可能的任何标准可以用来固定和嵌入协议。至于下面的挪威云杉嵌入看到略有不同，从拟南芥/油菜籽协议。
1.1第1天收集植物材料和多聚甲醛固定
- 收集感兴趣的植物材料，如果有必要剖析。置于冰上的组织，他们在冰冷的修复方案（见下面的食谱）直接或尽快注意 ！ 在冰上，把所有的时间 ！
- 应用真空样品多聚甲醛，直到开始起泡。保持真空到三个小时（如拟南芥和油菜花卉组织或挪威云杉雄球花一个小时的2 × 15分钟），并慢慢释放真空。组织应该固定液的真空渗透后下沉，但对于某些组织，含有大量的空气它是不可能的（如拟南芥花）。可以用一块纱布，使组织在固定液。
- 在4 ° C过夜（约12-16小时），轻轻摇晃更换固定液和孵化。
选项1
NB！挪威云杉嵌入版本如下（步骤4-8）。确保闪烁管，或至少在第5步，使用玻璃瓶 。
1.2第2天脱水注！挪威云杉嵌入版本。
暂停！这是可能的，停在这里，并储存在4 ° C的几个月在70％乙醇+ 0.85％的NaCl的组织。0.85％氯化钠 30分钟 在冰 50％乙醇+ 0.85％的NaCl 90分钟 在冰 70％乙醇+ 0.85％的NaCl 90分钟 在冰
NB！曙添加染色粉红色的组织，使它们更容易在嵌入和切片检测，但它可能会被排除在外。85％乙醇+ 0.85％的NaCl 90分钟 4 ° C 95％乙醇（曙红） 90分钟 4 ° C 100％的乙醇（曙红） 90分钟 4 ° C 100％的乙醇（曙红） 过夜 4 ° C
1.3第3天脱水和嵌入NB！挪威云杉嵌入版本。
| 100％的乙醇（曙红） | 2 H | 室温 |
| 50％的乙醇+ 50％Histoclear二 | 1 H | 室温 |
| 100％的Histoclear II | 1 H | 室温 |
| 100％的Histoclear II | 1 H | 室温 |
| 50％Histoclear II + 50％Histowax | 过夜 | +40-50 ° C |
1.4第4天嵌入注！挪威云杉嵌入版本。
100％融化Histowax 60 ° C （更改早晨和晚上）
1.5天5嵌入NB！挪威云杉嵌入版本。
100％融化Histowax 60 ° C （更改早晨和晚上）
1.6日6嵌入NB！挪威云杉嵌入版本。
NB！这是确定的，如果蜡偶尔改变，每天一次，但随后两天完成一天的变化。 蜡的变化也可以继续为两个额外的天，没有问题。 大样本“，这是建议，因为它有助于蜡渗透到这些组织的中心。100％融化Histowax 60 ° C （更改早晨和晚上）
选项2
NB！拟南芥/油菜籽嵌入版本如下（步骤4-8）。
1.2第2天脱水注！拟南芥/油菜籽嵌入版本。
- NB！所有步骤在4 ° C和轻轻摇晃，如果没有其他说明。
暂停！这是可能的，停在这里，并在4 ° C的几个月存储在70％乙醇的组织 。1X PBS 30分钟 1X PBS 30分钟 30％乙醇 60分钟 40％乙醇 60分钟 50％乙醇 60分钟 60％乙醇 60分钟 70％乙醇 60分钟
NB！曙添加染色粉红色的组织，使它们更容易在嵌入和切片检测，但它可能会被排除在外。85％乙醇 60分钟 95％乙醇（曙红） 过夜
1.3第3天的脱水和embeddING 注！拟南芥/油菜籽嵌入版本。
- NB！所有步骤，并在室温下轻轻摇晃，如果没有其他说明。
NB！组织转移到闪烁瓶或其他（玻璃）瓶。100％的乙醇（曙红） 30分钟 100％的乙醇（曙红） 30分钟 100％的乙醇（曙红） 60分钟 100％的乙醇（曙红） 60分钟
NB！在最后一步中的Histowax浓度并不重要，只是倒在一些蜡芯片。75％乙醇+25％Histoclear二 30分钟 50％的乙醇+ 50％Histoclear二 30分钟 25％的乙醇+ 75％Histoclear二 30分钟 100％的Histoclear II 60分钟 100％的Histoclear II 60分钟 100％Histoclear II + ¼卷Histowax芯片 过夜（无抖动）
1.4第4天嵌入注！拟南芥/油菜籽嵌入版本。
- 小瓶放置在42℃直至完全融化的蜡芯片与组织。下一步添加¼蜡芯片的体积，让他们完全融化。移动至+60 ° C，并留下了几个小时的小瓶。最后，取代蜡/ Histoclear二刚融化的蜡，并培育在夜间在+60 ° C。
1.5天5嵌入NB！拟南芥/油菜籽嵌入版本。
100％融化Histowax 60 ° C （更改早晨和晚上）
1.6日6嵌入NB！拟南芥/油菜籽嵌入版本。
NB！在拟南芥/油菜籽协议（挪威云杉协议相比），是第7天以同样的方式嵌入在每天5-6 ° C和变化早上和傍晚，即100％+60融化Histowax100％融化Histowax 60 ° C （更改早晨和晚上）
NB！这是确定的，如果蜡偶尔改变，每天一次，但随后两天完成一天的变化。 蜡的变化也可以继续为两个额外的天，没有问题。 大样本“，这是建议，因为它有助于蜡渗透到这些组织的中心。
1.7天7嵌入在拟南芥/油菜籽协议8（日）（Film!的技术细节在电影中 ）
- 预热培养皿菜肴和/或60模具° C。开启一个热点板块（60 ° C）和确保融化Histowax。
- 倒入培养皿放在热板（或模具）的组织和融化Histowax。添加使组织覆盖更多的Histowax。热的镊子，并均匀地分布在菜的组织分发。填写的培养皿（或模具）。如果蜡变硬前组织在合适的位置，热再次或删除一双镊子加热硬化蜡。
- 让蜡块变硬前在室温下放置在4 ° C。这是更好地使几个蜡块，而不是嵌入组织得太紧，因为蜡块可能打击件减少在切片时。
暂停！储存在4＆度; C.多年稳定的组织。
NB！这一步及以后的工作核糖核酸免费 。 使用手套，用DEPC治疗MilliQ水，缓冲区，玻璃器皿等，高压灭菌器的缓冲区和烘烤玻璃器皿等在适当的时候。
2。切片（Film!的技术细节在电影中 ）
- 打开两个热点板块（60 ° C和42 ° C）和确保融化Histowax。
- 热手术刀，从培养皿（它可能破解，如果一个人过于猛烈），小心地切出一个组织的蜡块，或从模具中取出。当一个单一的蜡块已经分开，塑造成片的权利的大小和形状，以方便在切片机切片。
- 蜡片应组织底下有一个额外的蜡“脚跟”，因此它可以连接到块的持有人。热块持有者和脚跟的热点板块（+60℃）和融合在一起。这可能是必要的Histowax第二下降到融合稳定。让我们在+4它变硬° C。
- 蜡块切成6-8微米厚的部分，长期使用切片机的色带连接。
NB！这将是容易，如果蜡块是冷的，即存储的蜡块在4 ° C和开始切割时，从冰箱里。 它也有利于保持刀冷。 - 研究放大镜部分的色带和标志要使用的。
- 无RNase MilliQ水放在幻灯片（探头，另加从费舍尔生物技术，预先清洗和带电）。切成小块剪彩，并把幻灯片（“后退”或“闪亮”的一面朝下）。应放在一个42 ° C盘用丝带幻灯片。色带应该扁平化水（这是很重要的！）。让部分坐了几分钟，然后用一个Kimwipe /纸巾，水漏。
- 留在该板块1-2个小时的幻灯片。
- 孵育在42 ° C过夜，使组织坚持以幻灯片的幻灯片。
暂停！建议尽快使用部分，但它们可以被保存在封闭的箱子干燥干燥剂几天在4 ° C。
3。探针的制作
原位杂交检测探针的具体使用一定的mRNA表达。探头，这是最常见的一块互补的RNA，可与地高辛，辛标记。辛是一种小分子，它可以连接到尿苷，从而纳入RNA探针，然后使用地高辛的特异性抗体检测。
探头的设计与制作，是在RNA原位杂交实验中最关键的一步。应谨慎，以确保探针具有高特异性和，是与高品质UTPs标记的。有时，杂交温度和/或反应的长度必须为特定的探头调整。与往常一样，应小心，以避免RNase的污染。
标签之前，隔离模板，根据您的标准协议，如cDNA克隆，PCR扩增片段，和线性模板。正义和反义片段被隔离，并从模板的使用基因特异性引物扩增。对于PCR扩增片段不使用酶产生3'突出。对所有碎片是一个T7（或SP6，或者T3）悬添加使用携带的T7序列的引物，或使用带有T7启动子一个载体。
感探头（mRNA或（ - ）链）有相同的序列的靶mRNA不会杂交的靶mRNA，而反义（反mRNA或（+）链）探针互补序列，从而杂交目标，使感兴趣的信号。感应探头是用来作为阴性对照，将获得实验工作正常，如果没有信号。阳性对照，也需要，例如一个看家基因探针检测。大多数的幻灯片，应与反义探针杂交，而只有几张幻灯片应不同的控制探针杂交。
3.1探针标记采用体外转录
从DIG RNA标记试剂盒（SP6/T7; 11175025910，罗氏应用科学部，曼海姆，德国）的试剂或类似的标记探针时使用。这里描述的20μL的反应应产量高辛标记的RNA〜10微克。
- 进行体外转录纳入标记的核苷酸。将下列试剂一管（保持冰）：
成分 数量/金额 10 × NTP标签的混合物 2μL 10 ×转录缓冲液 2μL 保护核糖核酸酶抑制剂 1μL（20U） RNA T7聚合酶（SP6，或者T3） 2μL 模板DNA（500-1000吴） xμL 无RNase MilliQ水 ŸμL，到终体积18μL - 混合的NTP标签的混合物，转录缓冲液，核糖核酸酶抑制剂（NB!如果探头是短期的，如<500bp，您可能会增加RNase抑制剂浓度为40U），聚合酶，模板DNA和水，然后短暂离心 。
- 孵育反应混合物在37 ° C为2小时（NB!如果探头是短暂的，例如：<500bp，增加反应时间4-6小时 ）。
- 15分钟，加入2μLDNA酶我在37和孵化° C。
- 停止反应，加入2μL0.2 M EDTA（pH值8.0）。检查凝胶产品。
- LiCl和4米75> 99.5％的乙醇液中加入2.5μL沉淀探头。拌匀，并培育在-20 ° C过夜（NB!不要使用为载体的tRNA，而是根据制造商使用的糖原或丙烯酰胺） 。
- （13 000 RPM）离心30分钟，4℃，去除上清。洗在70％乙醇沉淀（至少10分钟13 000转）的两倍（约150-300μL）。
- 去除上清，让颗粒干。重悬在30μL无RNase水冰1-2小时的探测。
暂停！探头可以储存在-20 ° C了一年多。
NB！保存从第21步（之前在体外转录），步骤23（DNA酶治疗前），第24步（DNA酶处理后，但降水前）0.5μL的样品和1μL样品从第27步（当探头已经重悬）。上一个nondenaturating 1％TBE凝胶运行的样本。如果工作正常的DNA酶反应模板的乐队将消失。在体外转录生成一个正确的大小约厚的RNA带。如果你看到多个频段，在80 ° C变性5分钟后淬火在装货前的冰样本 。 如果从步骤27的复苏很糟糕，因为它可能是探头不重悬于 。 孵育的RNA在55 ° C 5-10分钟得到解决方案。
3.2长期探头的水解
NB！如果您的探头是大于150 bp的应该减少到50-150 BP给予了很高的信号，由于更好地渗透。 探头可在碳酸盐缓冲液（pH值10.2），化学降解。如果探头跳过水解步骤的正确大小，但记得添加一个卷甲酰胺，即30μL，探头 。
- 准备0.2 M碳酸氢钠（碳酸氢钠3）和0.2 M碳酸钠（以Na 2 CO 3）。都应该是新鲜的。
- 测试混合5毫升H 2 O，2毫升0.2 M碳酸氢钠3和3毫升0.2 M NA 2 CO 3的两个缓冲区。 pH值应为〜10.2。
- 计算孵化时间：
孵化时间（分钟）=（L 0 - L F）/（K · L 0 * L F） L 0 =长度探头KB L F =探头的最终长度KB = 0.100如KB K =速率常数水解= 0.11 KB，1分钟1 - 水解探头的一半，其余保存以供日后。稀释探头与核糖核酸酶自由水50μL，加20μL0.2 M碳酸氢钠3（添加第一）和30μL0.2 M NA 2 CO 3。混合计算孵化时间，并在60 ° C孵育。
- 停止加入10μL的1 M NaOAc pH值4.7的反应。
- 沉淀加入10微升4个M氯化锂2和300μLethano探头L（NB!糖原或使用丙烯酰胺为载体，如果需要的话 ）。在-20 ° C过夜孵育。
- （13 000 RPM）离心30分钟，4℃，去除上清。在70％的乙醇（〜300μL）洗涤沉淀两次。离心（13 000 RPM），至少在每次洗10分钟在4 ° C。
- 去除上清，让颗粒干。重悬在30μL无RNase MilliQ水探头。添加一个卷甲酰胺，即30μL，探头。
暂停！探头可以储存在-20 ° C了一年多。
NB！取2μL不水解探针和2μL水解探针（前添加甲酰胺）和检查上nondenaturating 1％TBE凝胶。应该有两个样本之间的差异大小 。 探头可能需要在80 ° C变性5分钟后淬火在装货前的冰 。
4。 原位杂交（Film!技术详情载于电影 ）
确保所有解决方案都免费核糖核酸！这是没有必要DEPC对待一切，但至少使用蒸压MilliQ水。确保所有玻璃器皿加热在200 ° C过夜或至少5个小时。处理的塑料容器和搅拌搅拌0.1 M的氢氧化钠酒吧过夜。冲洗塑料容器蒸压MilliQ水（〜500毫升/容器）的好几倍。至关重要的是仔细冲洗容器的NaOH的痕迹，以避免可能扰乱杂交。 DEPC -治疗所有股票的解决方案，除三缓冲。检查开始前的实验，以确保一切可用所有解决方案等。直到第61步（步骤51-52除外），我们一直在机架上，这是很容易容器之间移动的幻灯片。
4.1 原位部分预处理
- Deparaffinize /脱水部分：
2X 10分钟Histoclear二（使用玻璃容器） 2个1-2分钟100％的乙醇 1-2分钟，95％乙醇 1-2分钟90％的乙醇 1-2分钟80％的乙醇 1-2分钟60％的乙醇 1-2分钟30％的乙醇 1-2分钟H 2 O - 洗15-20分钟，在室温（NB!准备在孵化时间在步骤42中使用的多聚甲醛）2X SSC的幻灯片。
- 治疗组织蛋白酶K 30分钟，在37 °彗星轻轻摇动（如1微克/毫升拟南芥/油菜籽和3微克/毫升挪威云杉）。混合并预热至37 ° C 100毫米的Tris pH值8和50毫米EDTA。立即治疗前的幻灯片添加蛋白酶K 注意！蛋白酶K的治疗需要优化组织，植物物种和年龄而定。 （NB!准备在孵化时间在步骤45中使用的三乙醇胺） 。
- 2 min，室温2mg/ml 1X PBS甘氨酸治疗的幻灯片。 （NB!混合，用PBS甘氨酸一天之前，使用它，以确保甘氨酸是正确溶解） 。
- 2分钟，在室温下1X PBS清洗幻灯片。
- 2分钟，在室温下1X PBS清洗幻灯片。
- 4％（W / V），多聚甲醛在1X PBS pH值7（新鲜）在室温孵育10分钟的幻灯片。使用玻璃容器。
- 在室温下，5分钟1X PBS清洗的幻灯片。
- 在室温下，5分钟1X PBS清洗的幻灯片。 （醋酸酐免除到在步骤45中的解决方案）。
- 孵育0.1M三乙醇胺（清新，pH值8）和醋酸酐在室温下10分钟的幻灯片。
- 在室温下，5分钟1X PBS清洗的幻灯片。
- 在室温下，5分钟1X PBS清洗的幻灯片。
- 脱水：
暂停！这是可以停在这里，并在4 ° C的几个小时，在一个容器中存储少量的乙醇在底 部的幻灯片 。30秒30％乙醇 30秒60％乙醇 30秒80％乙醇 30秒90％乙醇 30秒95％乙醇 2个30秒100％的乙醇
4.2 原位杂交（Film!的技术细节在电影中 ）
决定幻灯片使用该探头，不要忘了使用正义和反义探针，以及作为阳性对照。 （NB! ProbeOn加上费舍尔的生物幻灯片，允许他们在该协议的杂交/检测步骤对夹着一个白色的糖霜 。）与相同浓度相同的探针应该是一对特定的幻灯片。确定多少杂交的解决方案，以基于总数的幻灯片对。预热硫酸葡聚糖在+60 ° C。杂交液，硫酸葡聚糖是非常粘稠。将杂交液在60℃，它会更容易处理。空气干燥干净的纸巾或Kimwipe /组织文件的幻灯片应用前探。幻灯片等，必须完全干燥。对于每一个对幻灯片添加探头。重要的是要测试不同的探针浓度（如0.5，2和4μL），以找出最佳的浓度，在实际的实验是预制。
| 杂交液 | 5幻灯片对 | 10幻灯片对 | 15幻灯片对 | 20幻灯片对 |
| 在原位盐的10倍 | 100μL | 200μL | 300μL | 400μL |
| 去离子甲酰胺 | 400μL | 800μL | 1200μL | 1600μL |
| 50％硫酸葡聚糖（+60℃） | 200μL | 400μL | 600μL | 800μL |
| 50X登哈特的解决方案 | 20μL | 40μL | 60μL | 80μL |
| tRNA的（100mg/ml） | 10μL | 20μL | 30μL | 40μL |
| H 2 O（DEPC处理） | 70μL | 140μL | 210μL | 280μL |
| 总成交量 | 800μL | 1600μL | 2400μL | 3200μL |
- 探头在无RNase MilliQ水稀释到终体积20μL。添加量（即20μL）甲酰胺探头，给人一种总体积40μL。探头加热到80℃2分钟。放在冰上2分钟。自旋向下。探头置于冰上。这种探针混合物足够的一双幻灯片。乘以根据具体探头总数的幻灯片对。
- 每个幻灯片的终体积为200μL对每张幻灯片对（即160μL杂交液+ 40μL探头），添加160μL杂交液。混合而产生气泡。
- 探头应用到一个幻灯片，慢慢融合在一起的两个幻灯片。 （NB!夹心只能探头另加幻灯 片，或相当于幻灯片，如果使用无结霜幻灯片，而不是使用盖玻片夹 。 ）
- 提升在一个塑料容器，使用塑料移液器（其中密封件紧紧）以上的湿纸巾的幻灯片。杂交+50-55℃过夜（12-16小时）。
4.3原位杂交（后Film!的技术细节在电影中 ）
- 准备在原地后杂交变暖〜2 L 0.2X SSC（55 ° C）和〜2 L 1X新界东（37 ° C）过夜。如果执行的RNase处理（下面的步骤57-59）需要更多的南南合作和新界东。
- 浸入温暖0.2X SSC（见上文）每张幻灯片对分离和冲洗。然后在一个容器中，放置在一个机架0.2X SSC的温暖。
- 洗净0.2X SSC轻轻摇动60分钟的幻灯片，在55 ° C。 （NB!准备勃林格块解决方案，在孵化时间在步骤63中使用。）
- 重复在0.2X SSC洗为60分钟。 （NB!，如果执行的RNase第一步是让我在此孵化的RNase解冻，如果不继续加强 60 。）
- 可选：洗在温暖的1X新界东5分钟（见上文）的幻灯片，在37℃，轻轻摇动。
- 可选：重复在温暖的1X新界东洗5分钟，在37 °温柔agtation彗星。
- 可选：将与核糖核酸（20微克/毫升核糖核酸酶在1X新界东）30分钟在37 °与轻轻摇动的幻灯片。然后洗净1X新界东5分钟，在37 °轻轻摇动的彗星。重复1X新界东洗。
- 在55℃，轻轻摇动，在0.2X SSC 60分钟洗净的幻灯片。 （NB!准备步骤64-65和67块的解决方案，在孵化时间。）
- 5分钟，在室温（Pause!您可能1XPBS幻灯片存储在4 ° C过夜，如果你想继续第二天 。）1X PBS清洗幻灯片
- 样品的一面朝上一家大型塑料容器的底部放在幻灯片。
- 孵育1％勃林格块100毫米的Tris pH值7.5，150 mM氯化钠在室温下轻轻摇动45分钟的幻灯片。与阻塞的解决方案，刚好盖住幻灯片。倒掉阻塞的解决方案，而幻灯片仍然是在塑料容器中，或放置在一个新的容器的幻灯片。浇筑时的解决方案的幻灯片通常坚持的塑料容器，但确保他们不会脱落的容器。
- 在100毫米的Tris pH值7.5，150 mM氯化钠，0.3％TRITON X - 100，1.0％BSA取代勃林格块解决方案。孵化执行步骤63。
- 在步骤64中的BSA /三/氯化钠/海卫一的溶液稀释的抗- DIG抗体（1:1250，即8μL于10 ml BSA的抗体）。在一个塑料的一个水坑抗体溶液重量的菜。夹心幻灯片一起让毛细力拉起来的解决方案。漏Kimwipe /纸巾和重复，尽量避免气泡。
- 提升以上的湿纸巾，塑料容器的幻灯片，让幻灯片在室温下坐了2小时。
- Kimwipe /纸巾和独立的排水幻灯片。塑料容器的底部放置在步骤63。洗4X在BSA /三/氯化钠/海卫一的解决方案。每次15分钟的时间，在室温下轻轻摇动。
- 10分钟100毫米的Tris pH值9.5，100毫米氯化钠，50毫米MgCl 2的 。塑料容器的底部放置在步骤63。
- 浸在Tris pH值9.5/NaCl/MgCl 2解决方案的幻灯片，以确保所有的洗涤剂洗掉。
- 做三明治和借鉴西方蓝溶液在65。再重复一次。
- 在室温下1-5天在完全黑暗的环境（锡纸包装）湿纸毛巾以上的塑料容器的幻灯片。检查后，6，12和24小时，然后每天一次。
- 漏幻灯片，在1xTE冲洗停止反应。盖玻片幻灯片之前，在显微镜下检查。幻灯片可以保存几个月，但在1x TE拍照尽快。
食谱/股票解决方案
NB！使用无RNase MilliQ水尽可能多，例如，用DEPC处理MilliQ水（加入0.1％DEPC留下过夜。高压灭菌15磅（20分钟，即1.05公斤/ 厘米 2，液体周期，）或使用至少蒸压MilliQ的水。当准备缓冲区和股票的解决方案，它也可能溶于无RNase盐等DEPC处理过的水，而不是用DEPC处理的缓冲区和股票的解决方案本身，如果你不DEPC处理水，缓冲区和股票的解决方案，至少有高压灭菌器或过滤消毒。
暂停！在室温下存储缓冲区和股票的解决方案，如果没有其他说明。
NB！你可以找到许多的缓冲区，以及关于如何使他们在分子克隆（2001年萨姆布鲁克J，和DW拉塞尔。的提示。分子克隆实验室手册“3版。冷战冷泉港实验室出版社，冷泉港纽约，美国）。
醋酸酐0.1M三乙醇胺（pH值8，体积：800毫升）。
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| 三乙醇胺 | 10.4毫升 | 0.1中号三乙醇胺 |
| MilliQ的水 | 786.4毫升 | 终体积为800毫升 |
| 盐酸 | 3.2毫升 | 给予pH值8.0 |
| 醋酸酐 | 4.8毫升 | 0.6％ |
- 为了使pH值8.0，0.1 M的三乙醇胺缓冲，稀三乙醇胺10.4毫升786.4毫升的H 2 O，加3.2毫升盐酸，使pH值至8.0（检查与酸碱指示剂）。
- 提升架破10毫升塑料吸液管或类似容器，在底部的搅拌棒在三乙醇胺的幻灯片。
- 免除到三乙醇胺前几分钟把幻灯片，它是混合以及4.8毫升醋酸酐。
NB！请0.1M三乙醇胺新鲜和孵化前添加醋酸酐。
NB！使用玻璃容器。三乙醇胺缓冲使用的醋酸酐是因为在水中不稳定。
琼脂糖（1％）凝胶在1 × TBE（体积：100毫升）
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| 琼脂糖 | 1克 | 1％ |
| 1 x TBE | 100毫升 |
混合琼脂糖1 × TBE。热/煮至琼脂糖融化。蒙上了凝胶。运行1 × TBE缓冲液中的凝胶。
硫酸葡聚糖
稀释5克葡聚糖DEPC处理MilliQ水（即50％（W / V））硫酸10毫升，溶于60 ° C
暂停！储存在-20 ° C。
0.5 M EDTA pH8.0（titriplex三，体积为500毫升）
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| EDTA（372.24克/摩尔） | 93.06摹 | 0.5 M EDTA |
| MilliQ的水 | 500毫升 | |
| 氢氧化钠 | 〜10克颗粒 | 给予pH值8.0 |
| 用DEPC | 0.5毫升 | 0.1％DEPC |
溶解于水（pH值8.0的情况）EDTA，调整到终体积为500毫升。添加0.1％DEPC。在夜间离开。高压灭菌。
修复液/固色剂（步骤1-3，42） - 4％（W / V）1X PBS，pH值7.0（650毫升）多聚甲醛
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| MilliQ的水 | 585毫升 | |
| 10X PBS | 65毫升 | 1X PBS |
| 10M的NaOH | 520μL | 给予pH值〜11 |
| 多聚甲醛 | 26日摹 | 4％ |
| 浓盐酸 | 449μL | 给人的pH〜7 |
- PBS和NaOH混合水，并加热至+60-70 ° C（温度和高pH值，使其更容易溶解的多聚甲醛。
- 添加（通风柜）多聚甲醛。
- 当解决方案已被清除，将其置于冰上，加入449μL浓盐酸调节pH至7.0。
NB！作出新的。
NB！在云杉协议戊二醛添加到终浓度为0.25％，即6.5毫升的总容积为650毫升或10毫升1000毫升的总量25％的戊二醛25％戊二醛（记住水，以减少与平等体积）。
NB！吐温20和/或Triton X - 100添加几滴调整后的pH值，降低表面张力，以方便固定在步骤1-3。不要使用在步骤42！
NB！一般需要较小的体积（如100 - 200毫升）的固定液固定植物组织。
原位盐10X（体积为100毫升）
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| 5 M氯化钠 | 60毫升 | 3M氯化钠 |
| 1 M Tris - CL的pH值8.0 | 10毫升 | 0.100立方米三 |
| 1米钠磷酸盐pH值6.8 | 10毫升 | 0.100立方米钠磷酸盐 |
| 0.5 M EDTA | 10毫升 | 0.050中号EDTA |
| MilliQ的水 | 100毫升 |
钠磷酸盐缓冲液pH值6.8（46.3毫升1个M娜2 HPO 4 + 53.7毫升1米的NaH 2 PO 4）混合。混合盐，三，钠磷酸盐缓冲液，EDTA和水。高压灭菌。 暂停！储存在-20 ° C。
4米2（体积：100毫升氯化锂，氯化锂）
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| 氯化锂2（42.39克/摩尔） | 16.956克 | 4M氯化锂2 |
| MilliQ的水 | 100毫升 | |
| 用DEPC | 0.1毫升 | 0.1％DEPC |
溶解于水的氯化锂 2，调整终体积为100毫升。添加0.1％DEPC。在夜间离开。高压灭菌。
暂停！储存在4 ° C。
1个M氯化镁2 · H 2 O（氯化镁，体积：100毫升）
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| 氯化镁2 · H 2 O（203.30克/摩尔） | 20.33摹 | 1个M氯化镁2 · H 2 O |
| MilliQ的水 | 100毫升 | |
| 用DEPC | 0.1毫升 | 0.1％DEPC |
溶解于水氯化镁2，调整终体积为100毫升。添加0.1％DEPC。在夜间离开。高压灭菌。
NB！ MgCl 2的是非常吸湿性。不要长时间储存开瓶。
5 M氯化钠（氯化钠，体积：1升）
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| 氯化钠（58.44克/摩尔） | 292.2摹 | 5 M氯化钠 |
| MilliQ的水 | 至1L | |
| 用DEPC | 1毫升 | 0.1％DEPC |
氯化钠溶解于水，调整到终体积1 L.添加0.1％DEPC。在夜间离开。高压灭菌。
1个M NaOAc pH值4.7（醋酸钠，体积：100毫升）
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| NaOAc（82.03克/摩尔） | 0.8203克 | 1中号NaOAc |
| MilliQ的水 | 100毫升 | |
| 乙酸 | 给予pH值4.7 | |
| 用DEPC | 0.1毫升 | 0.1％DEPC |
NaOAc溶解于水。调整pH值至4.7。调整终体积为100毫升。添加0.1％DEPC。在夜间离开。高压灭菌。
0.2 M NA 2 CO 3的 pH11.4（碳酸钠，体积：10毫升）
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| NA 2 CO 3 | 0.21198克 | 0.2 M NA 2 CO 3 PH = 11.4 |
| MilliQ的水 | 10毫升 |
的Na 2 CO 3在水中溶解，调整到10毫升的最终体积。 pH值应为11.4。
NB！作出新的。
0.2 M碳酸氢钠3 pH8.2（碳酸氢钠，体积：10毫升）
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| 碳酸氢钠3 | 0.16802克 | 0.2 M碳酸氢钠3：pH值= 8.2 |
| MilliQ的水 | 10毫升 |
溶解于水的碳酸氢钠 3调整到10毫升的最终体积。 pH值应为8.2。
NB！作出新的。
1个M NA 2 HPO 4 · 2 H 2 O（500毫升）
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| 娜2 HPO 4 · 2 H 2 O（177.99克/摩尔） | 88.995克 | 1个M NA 2 HPO 4 |
| MilliQ的水 | 500毫升 | |
| 用DEPC | 0.5毫升 | 0.1％DEPC |
NA 2 HPO 4溶解于水，调整到500毫升的最终体积。添加0.1％DEPC。在夜间离开。高压灭菌。
1米的NaH 2 PO 4 · H 2 O（500毫升）
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| 的NaH 2 PO 4 · H 2 O（137.99克/摩尔） | 68.995克 | 1米的NaH 2 PO 4 |
| MilliQ的水 | 500毫升 | |
| 用DEPC | 0.5毫升 | 0.1％DEPC |
溶解的NaH 2 PO 4的水，调整到500毫升的最终体积。添加0.1％DEPC。在夜间离开。高压灭菌。
5倍新界东（总容积：1L）
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| 5 M氯化钠 | 500毫升 | 2.5 M氯化钠 |
| 1 M Tris - CL的pH值8 | 25毫升 | 50毫米的Tris - CL pH值8 |
| 0.5 M EDTA | 5毫升 | 5毫米EDTA |
| MilliQ的水 | 第470笔资料毫升 | 最终卷1升 |
混合盐，三，EDTA和水。不要DEPC治疗的。高压灭菌。
10 × PBS（磷酸盐缓冲液）的pH值7.0（总容积：1L）
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| 5 M氯化钠 | 260毫升 | 1.3 M氯化钠 |
| 1个M NA 2 HPO 4 | 70毫升 | 70毫米的Na 2 HPO 4 |
| 1米的NaH 2 PO 4 | 30毫升 | 30毫米的NaH 2 PO 4 |
| MilliQ的水 | 640毫升 | 最终卷1升 |
| 用DEPC | 1毫升 | 0.1％DEPC |
混合盐，钠2 HPO 4的NaH 2 PO 4和水。用HCl调节pH值pH值7.0。添加0.1％DEPC。在夜间离开。高压灭菌。
20X SSC pH值7.0（总容积：1L）
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| 氯化钠（58.44克/摩尔） | 175.32克 | 3 M氯化钠 |
| 柠檬酸钠（294.1克/摩尔） | 88.23摹 | 中号钠柠檬酸0.300 |
| MilliQ的水 | 1升 | |
| 盐酸 | 给予pH值7.5 | |
| 用DEPC | 1毫升 | 0.1％DEPC |
解散NaCl和NA〜800毫升的水柠檬酸。用HCl调节pH值pH值7.0。调节音量与水1升。添加0.1％DEPC。在夜间离开。高压灭菌。
5 × TBE（体积：1L）
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| 三（121.14克/摩尔） | 54摹 | ~~ 0.45米TRIS |
| 硼酸（61.83克/摩尔） | 27.5摹 | 〜0.45米硼酸 |
| EDTA（372.24克/摩尔） | 3.7摹 | 〜0.01 M EDTA |
| MilliQ的水 | 至1L |
混合三，硼酸，EDTA和水。 pH值应为8.3〜。使用前，稀释至1 × TBE。
10 × TE pH值8.0（TRIS EDTA，体积：1L）
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| 1米，pH值8.0的Tris - CL | 100毫升 | 0.100立方米的Tris - CL |
| 0.5 M EDTA pH8.0 | 100毫升 | 0.050中号EDTA |
| MilliQ的水 | 至1L |
混合三，EDTA和水。不要DEPC治疗的。高压灭菌。
NB！三，不应DEPC处理过的！使用无RNase的粉末和DEPC-treated/RNase-free MilliQ水稀释 。
1米的Tris - HCl pH值7.5 - 9.5（500毫升）
| 成分 | 数量/金额 | 终浓度 |
| 三（121.14克/摩尔） | 60.57摹 | 1中号三 |
| MilliQ的水 | 500毫升 | |
| 盐酸 | 给予pH值7.5 | |
| 盐酸 | 给予pH值8.0 | |
| 氢氧化钠 | 给予pH值9.5 |
溶解于DEPC处理过的水的TRIS。调整所需的pH值。调整到终体积为500毫升。高压灭菌。
NB！三，不应DEPC处理过的！使用无RNase的粉末和DEPC-treated/RNase-free MilliQ水稀释 。
NB！ （见上文）的分子克隆是一个表，说明多少集中盐酸是需要达到正确的pH值。
材料与方法
在原位协议和电影。这里附加在这个特定示例中使用的植物材料和探头的信息。
植物材料和实验设计
来自欧洲云杉男球果属喀斯特。 （挪威云杉），收集在2007年秋季，瑞典乌普萨拉。八圆锥切片和部分从每个锥被用来在每个治疗。三个蛋白酶K的浓度进行了测试; 1，3和5微克/μL，每个浓度或无RNase的处理。核糖核酸酶治疗期间未用RNase处理的幻灯片被留在PBS拟南芥 [L.] Heynh 。 甘蓝型油菜 ，在22个文化室控制的条件下下生长° C/18 ° C昼/夜温度和16小时光照含有花芽，年轻0-10阶段（阶段，根据史密斯5）花序进行了研究。
cRNA探针
从体育中提取总RNA 冷杉雄球花如前所述6， 从 A 拟南芥和 B。 油菜用Trizol（Gibco BRL公司，冯检基，马里兰州，美国）和Qiagen公司的RNeasy植物试剂盒（QIAGEN，Hilden的，德国），分别按照制造商的建议，。合成cDNA，从0.5-1微克总RNA种类的不同，使用标三反转录酶（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，美国加利福尼亚州）按照制造商的说明。AtAP3和BnAP3正义和反义片段和P.冷杉感片段进行分离，扩增基因特异性引物（表1）。DAL13反义片段进行分离和扩增引物7 。 从 A片段添加到一个T7悬拟南芥和页冷杉 ，使用携带的T7序列（见表1）修改的反向引物。一个500 bp的片段，是孤立的， 用 BnAP3特异性引物（表1），并克隆到pGEM - T载体T7 -启动子与一个。所有PCR反应在终体积20μL含0.2 ü Phusion DNA聚合酶（Finnzymes，埃斯波，芬兰），1X Phusion HF缓冲，每一个dNTP的200微米，高Fidility 0.3μM每个体育冷杉片段使用底漆和25-50毫微克的cDNA和一个标准的PCR程序退火温度60-55℃（触摸式-10 ° C /周期）55 ° C。正义和反义cRNA的所有三个品种的探头在体外使用DIG RNA标记试剂盒（SP6/T7;罗氏应用科学部，德国曼海姆）转录根据制造商的建议和长探头消化约100-150 bp的合成碎片使用一个Na 2 CO 3缓冲按3。
结果
在结果节中，我们描述三个不同的典型结果例子， 从现场试验。
似乎是进化保守的7-9，尽管这两个种子植物谱系2.85亿年前，10分开，规定在指定的男性和女性的器官特征裸子植物和被子植物生殖发育的遗传机制。 在 A 拟南芥的花卉APETALA3（AP3 11）和PISTILLATA同源基因（PI 12）是必要的和足够花的上下文内指定男性生殖发育，这个功能似乎是沿袭 13被子植物内保守。在裸子植物，没有鲜花和他们的生殖器官，在单独的男性和女性的视锥细胞（图1A - C）， 基因排列同源 AP3和PI，具体表现为男性锥 ，microsporophylls 7,14花粉轴承机关。因此，一个类似的设置定义的同源基因在被子植物和裸子植物花粉轴承机关。
基因特异性探针，分别对AtAP3 BnAP3执导，从第3阶段在一个区域对应的螺纹两个年轻的花芽的信号和A中的三个拟南芥和 B。 甘蓝型油菜 。在稍后举行的信号被限制发展的花瓣和花蕊（图2A和B）的花蕾。这些结果是在以往的研究与11,15,16协议。针对P. AP3同源的探头冷杉，DAL13，生产体育 microsporophylls信号冷杉雄球花顶端分生组织终止之前和之后（图2C和D），如预期般从7,14以前的研究。检测探头没有上述背景信号（图3A - B和数据未显示）。两者合计，这些结果表明A 的表达拟南芥AP3及其同源基因在 B 型油菜与P.在发展中国家男性生殖器官的冷杉。
拟南芥和 B 图1。 甘蓝型油菜的花和花粉生产的针叶树体育雄球花冷杉图片显示花芽花序开的花和拟南芥和B.napu在A和 B分别。需要注意的是被子植物花除了从无菌花被港口男性和女性生殖器官，雄蕊和心皮。 在 C中显示的是一根树枝裸子植物体育冷杉与绿色营养针和红色男性生殖锥。
图2 A 的表达。 拟南芥的 AP3和B 中的同源基因型油菜与P.冷杉 。显微照片表明A.纵向部分拟南芥和 B。在A和 B，分别和 P 型油菜花序在C和 D 冷杉雄球花。节对AtAP3 A和乙 BnAP3在第二和第三螺纹花器官的显示信号指示的反义探针杂交。数字表明花香阶段，根据史密斯 5 。针对DAL13基因的反义探针信号的 P.花粉轴承microsporophylls 冷杉雄球花，在CD所示。 microsporophylls的例子是用箭头表示。在AD点杂交信号的箭头，这似乎为紫色。酚类化合物在C和D棕非特异性的颜色，单个细胞在中央髓部。萼片; S，P，花瓣，雄蕊，ST，C，心皮; MS，microsporophyll; PI，髓; PP;前花粉细胞。酒吧：100微米。
图3。DAL13表达P.雄球花冷杉 。顶端分生组织终止后的所有照片（AH），雄球花的纵向部分。箭头指向细胞类型， 其中 DAL13表示。在A和B的部分杂交，从某种意义上讲控制探针来确定背景染色。显微照片彗星到 H与DAL13反义探针杂交。部分从实验和无RNase的治疗表明，在D，F，H和C，E，G分别。从1μg/ ml的蛋白酶K实验的显微照片显示在C和D，在E和F 3微克/毫升，5μg/ ml的G和H酒吧：100微米。
Discussion
两方面的P.冷杉协议进行了优化比较的A.拟南芥/ B油菜协议，治疗核糖核酸酶和蛋白酶K的浓度。的RNase去除背景信号，从而增加了信号的特异性17。蛋白酶K的治疗是需要通透的组织，使探针可以进入和杂交利益的RNA池。 DAL13反义探针了一个更高的信号无RNase的治疗（图3C，E，G）相比，用RNase处理的部分为30分钟（图2D，F和H） 。由于核糖核酸治疗没有增强信号，这是从协议中删除。蛋白酶K的治疗进行了测试三种不同的浓度; 1，3和5微克/毫升。在P 的情况下冷杉一个低或无信号，观察使用1μg/ ml的蛋白酶K（图3C - D）。一个强烈的信号，两个3微克/毫升（图3E - F）和5微克/毫升（图3G - H）的蛋白酶K由于没有明显的差异，信号强度时发现使用5微克/毫升的蛋白酶K 3微克/毫升相比，我们选择使用我们的协议在3微克/毫升。很可能需要较高的蛋白酶K含量的体育冷杉相比，雄球花的A.拟南芥和 B。 油菜花芽是由于更紧凑的组织水平较高的酚类物质和多糖。
在固定和嵌入的A.之间的一些分歧拟南芥/ B甘蓝型油菜的协议和在体育冷杉协议是显而易见的。是固定的利益的组织提供RNA的保留，这是关键的一步，因为不好固定材料可能会低或检测不到信号，即使mRNA的是非常丰富的。组织脱水，清除和嵌入式蜡在逐渐变化，以避免组织损伤，并在一些协议0.85％的NaCl添加乙醇脱水，以进一步避免收缩和肿胀的细胞 3 。嵌入过程中的脱水步骤，可在冰上进行，保持在最低RNase活性。在体育冷杉协议的4％多聚甲醛修复方案包含0.25％的戊二醛，这是应该给予更好的 RNA保留17尽管有些人认为它可能没有什么区别3。后切片材料固定到幻灯片和预处理（即脱蜡，水化，透，处理，以减少非特异性结合的探针，最后脱水）杂交前。
信号的发展，整个检测过程在这里提出的协议可在普通实验室进行，通常在1-3天，超过背景信号之间的比例可以不断地进行监测。辛标记的探针通常会更鲜明的信号相比，放射性标记的探针，更稳定，可在连续的实验重用。另一方面，灵敏度降低相比，17个放射性探针原位杂交检测表达一定的mRNA的具体使用探针。射频标签是一个强大的和敏感的标记方法，但它需要处理的放射性物质，它需要几个星期前可检测的结果。另一方面抗原标记的探针，更稳定，危险性较小，需要接触到一个只有17几天的检测介质。因此，抗原标记方法是目前的主导。最关键的一步，不管协议是探头的设计。应谨慎，以确保探针具有高特异性和，是与高品质UTPs标记的。有时，杂交温度和/或反应的长度必须为特定的探头调整。
修改后的协议，基于高辛标记探针将促进mRNA的表达本地化， 同时在从A不等的物种拟南芥到 P 冷杉 ，应稍作调整在其他植物中使用。该协议，雄球花旁，也进行了测试在不同阶段的营养芽和合子和体细胞胚胎从P.冷杉与良好的结果（未公布结果;高本汉等 ）。
Disclosures
作者们没有透露。
Acknowledgments
我们非常感谢志愿扬声器的声音安德斯Bovin提供我们的电影音乐和迈克尔埃利奥特股市。提供了支持卡尔Trygger基金会战略研究计划农业功能基因组学在瑞典农业科学院，瑞典研究理事会（VR）的大学（AgriFunGen），瑞典研究理事会和环境，农业科学，空间规划（FORMAS ）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich | A6404-200ml | minimum 98% |
| Acrylamide, linear | Ambion | 9520 | |
| Anti-DIG-antibodies | Roche Group | ||
| Blocking reagent | Roche Group | 11 175 041 910 or 11 096 176 001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50g | minimum 98% |
| Deionized formamide | Sigma-Aldrich | ||
| Denhardts solution | Sigma-Aldrich | D2532-5ml | |
| DEPC, diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Dextran sulfate | Sigma-Aldrich | ||
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Roche Group | 11175025910 | |
| Glutaraldehyde (25%) | Histolab | ||
| Glycogen | Ambion | 9510G | |
| Histoclear II | Histolab | You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue. | |
| Histowax | Histolab | Histowax or Paraplast can be used for embedding. | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500g | |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | P3683-1kg | Histowax or Paraplast can be used for embedding. |
| Phusion™ High-Fidility DNA Polymerase | Finnzymes | ||
| Probe-on Plus slides | Fisher Scientific | 22-230-900 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-5mg | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R5503-100mg | |
| Tissue-clear | Sakura Finetek | You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue. | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | T1377-100ml | minimum 98% |
| Triton X-100 | use your standard product in the lab | Use one or both of Triton X-100 and Tween-20. | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 83853-100mg | |
| Tween-20 | use your standard product in the lab | Use one or both of Triton X-100 and Tween-20. | |
| Western Blue | Promega Corp. |
References
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