لإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لايف التصوير باستخدام بروتوكول إسقاط الشنق

Summary

ويقدم طريقة بسيطة وغير مكلفة وفعالة للتحضير للأجنة ذبابة الفاكهة تعيش التصوير التحليل. بروتوكول يتيح لنا الرطوبة والغاز والصرف لا ضغط الجنين ذبابة الفاكهة. هذا الأسلوب هو مناسبة لGFP القائم على التصوير المباشر للأجنة ذبابة الفاكهة باستخدام stereomicroscope أو تستقيم المجهر المركب.

Abstract

الأخضر ببروتين (GFP) المستندة timelapse الحية هي تقنية التصوير القوية لدراسة التنظيم الجيني للعمليات الحيوية مثل الأنسجة التشكل ، خلية التصاق الخلايا ، أو موت الخلية. يتم تصويرها بسهولة أجنة ذبابة الفاكهة معربا عن GFP باستخدام المجهر مجسمة أو مبائر. والهدف من أي بروتوكول الحية التصوير للحد من الآثار الضارة مثل الجفاف ونقص الأكسجين. وقد شملت البروتوكولات السابقة لإعداد أجنة ذبابة الفاكهة لحية التصوير تحليل وضع الأجنة dechorionated في مجال النفط والهالوكربون يقحم عليها بين الهالوكربون الغاز نفاذية الغشاء وساترة a

Protocol

إعداد

1. جمع الأجنة على مستوى لوحات أجار عصير العنب ^4. وهو ملائمة لاستخدام الآلية ذبابة الفاكهة جامع البيض (Flymax العلمية معدات المحدودة). متزامن باستخدام نظم مجموعات الجنين وتقليل عدد dechorionations التي يجب تنفيذها من أجل الحصول على أعداد كافية من الأجنة في هذه المرحلة التنموية المنشودة.
2. إعداد شريحة dechorionation عن طريق ربط قطعة من الشريط على الوجهين إلى شريحة المجهر ، وإزالة الدعم من الشريط.
3. إعداد غرفة التصوير العيش عن طريق قطع قطعة من النسيج لتناسب في البئر للغرفة. مكان النسيج في البئر والرطب مع الماء المقطر.
4. مزيج النفط الهالوكربون سلسلة اللزوجة (الهالوكربون منتجات شركة) 700 وسلسلة 56 في نسبة 1:1. ويمكن تخزين واستخدام خليط غير مسمى.
5. المكان عدة قطرات صغيرة من النفط الهالوكربون على سطح ساترة (22 X 40 مم ، رقم 2). حجم يست حرجة لكنها يجب أن تكون في ترتيب ميكرولتر 20-40.

إجراء

1. مع المعونة من stereomicroscope ، وجمع من الأجنة لوحات عصير العنب أجار باستخدام زوج من المجوهرات ملقط (رقم 5) أو فرشاة الطلاء دقيقة للغاية. أجنة تميل إلى التمسك ببعضها البعض ونصائح للملقط '؛ يتجمع بسهولة في كتل.
2. مع المعونة من stereomicroscope ، وانخفاض بلطف كتل من الأجنة التي انضمت الى نصائح من ملقط على سطح الشريط على الشريحة dechorionation.
3. مرة أخرى باستخدام stereomicroscope ، دفع برفق أو السكتة الدماغية الأجنة مع الجانب من الملقط من أجل كسر فتح المشيماء الخارجي شمعي بدون تمزق الغشاء المحي الداخلية (الجنين سوف تنفجر إذا ما تمزق الغشاء المحي).
4. بمجرد تمزق المشيماء الخارجي ، ندف الجنين من المشيماء ؛ الجنين dechorionated يميل إلى الانضمام إلى السطح من الملقط. الحرص على تجنب لمس الجنين dechorionated على سطح الشريط.
5. حالما يتم dechorionated الجنين ، ونقل بسرعة إلى انخفاض معدة مسبقا من النفط الهالوكربون على ساترة. تلمس غيض من يحمل ملقط الجنين dechorionated إلى السطح من الهالوكربون انخفاض اسعار النفط -- وهذا يزيح الجنين من الملقط في النفط.
6. تأكيد نقل الجنين الى انخفاض اسعار النفط. ويمكن القيام بذلك مع بالعين المجردة بشرط أن تعمل على خلفية سوداء ، واستخدام مصدر الإضاءة الألياف البصرية التي وضعت في زاوية مائلة.
7. قبل محاولة أخرى dechorionate جنين ونظيفة من أي نفط ملقط. ملقط المغلفة في شراء النفط أقل على سطح المشيماء ، مما يجعل dechorionation أكثر صعوبة.
8. Dechorionated الأجنة هي في مجال النفط المزدهر الهالوكربون. باستخدام الملقط أو الفرشاة ألف وأثناء عرض خلال stereomicroscope ، ودفع الجنين إلى أسفل من انخفاض اسعار النفط وترتيب في الموضع المطلوب.
9. عكس بسرعة ساترة على مدى جيدا للغرفة التصوير الحي. تأكد من أن الأجنة يستريح ضد ساترة في الاتجاه المطلوب. نظرا لحيويتها في مجال النفط ، سوف تطفو على أجنة الآن ضد السطح السفلي للساترة. إصلاح ساترة إلى غرفة التصوير العيش مع الشريط. تهوية الغرفة بقطع ثقوب في الشريط في المنطقة التي تمتد على الشريط الفجوة بين نهاية ونهاية ساترة من البئر للغرفة التصوير الحي.
10. ويمكن الآن مجهر مضان تستقيم أو stereomicroscope مضان يمكن استخدامها لصورة الأجنة.

Discussion

نحن تصف طريقة جديدة لإعداد أجنة ذبابة الفاكهة لتحليل التصوير الحي ، الذي نسميه بروتوكول قطرة شنقا. لسوء الحظ ، فإنه ليس من الممكن استخدام بروتوكول إسقاط عقوبة الاعدام شنقا اذا عمل مع مجهر مقلوب. ويجب في هذه الحالة يمكن استخدام هذه التقنية يقحم (كما هو موضح في أعلاه مجردة) ، وضغط من الأجنة لا تزال مصدرا للقلق.

في التجارب حيث يتم قياس حجم وشكل خلية لحساب القوات التابعة لحركة التخلق ، واستخدام المجهر تستقيم وبروتوكول قطرة شنقا هو الأفضل نظرا لضغط الجنين مخفضة. أيضا ، وانخفاض ضغط الجنين باستخدام بروتوكول قطرة شنقا لديه نتيجة لتعرض السطح الدائري ، غير مشوهة للجنين في حين أن تقنية يقحم يعرض سطح بالارض. عند استخدام الفحص المجهري متحد البؤر هو ، بالتالي ، من الضروري جمع. أوسع Z - المكدس (أكثر الشرائح في كومة) عند استخدام بروتوكول قطرة شنقا في مقابل الأسلوب يقحم زيادة عدد الشرائح في Z - مكدس ، ومع ذلك ، ويزيد من اكتساب الوقت ، وكذلك أي السمية الصورة أو تبييض الصورة المرتبطة مع الإثارة الليزر. بوضوح ، ويعوض بعض الشيء لصالح التجريبية المرتبطة ضغط بنسبة زيادة في أوقات اكتساب Z - المكدس. على الرغم من هذه الزيادة في الوقت اقتناء Z - المكدس ، ومع ذلك ، فقد لاحظنا استمرارية ممتازة للأجنة باستخدام بروتوكول قطرة شنقا.

غير محدودة أيضا بروتوكول قطرة شنقا لمراقبة الأجنة المجهري مضان ، حيث المسار ضوء الحادث والضوء المنبعث لا تمر عبر غرفة حية التصوير. ويمكن تحقيق العيش التصوير المجهري باستخدام أجنة مدينة دبي للإنترنت أو غيرها من البصريات غير مضان بتعديل غرفة حية التصوير للسماح للمسار الضوء من خلال المكثف للجنين مع وقف التنفيذ.

ويجوز للقلق عند استخدام تقنية هبوط شنقا تكون حركة غير مرغوب فيها أو "الانجراف" للأجنة في مجال الرؤية خلال اقتناء timelapse. عندما يتحرك ضد السفلي من ساترة المقلوب ، نجد أن الأجنة بشكل ملحوظ وثابت لا تغيير في الموقف عند استخدام إما جافة أو أهداف غمر النفط. timelapse اقتناء متعددة باستخدام المجهر بمحركات المرحلة أيضا لن يؤثر سلبا على مواقف الأجنة التي يتم إعدادها باستخدام بروتوكول قطرة شنقا. يمكن القضاء على أي حركة للأجنة باستخدام تقنية أعدتها قطرة شنقا عن طريق تخفيض حجم الهالوكربون انخفاض اسعار النفط ، وضمان أن قطرات النفط ليست منفصلة أو فتل الصمامات على طول حافة يعيش في غرفة التصوير أيضا.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides
coverslips (22 x 40 mm, No. 2)
double-sided tape
jeweller’s forceps (Dumont style No. 5)
halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.)
a utility knife or single edge razor blade
tissue paper
scissors
distilled water
general purpose tape
a pipet suitable for delivering 20-40 μl.
The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required.