Summary
ライブイメージング解析のためのショウジョウバエの胚を作製する、シンプルで安価な、そして効果的な方法が提示される。我々のプロトコルは、湿度およびガス交換を提供し、ショウジョウバエの胚を圧縮しません。このメソッドは、実体顕微鏡や正立複合顕微鏡を用いてショウジョウバエの胚のGFPベースのライブイメージングに適しています。
Abstract
緑色蛍光タンパク質（GFP）をベースボックスに追加ライブイメージングは、そのような組織の形態形成、細胞間接着、または細胞死などの動的過程の遺伝的調節を研究するための強力な手法です。 GFPを発現するショウジョウバエの胚は、容易にどちらかの立体または共焦点顕微鏡を用いて画像化している。あらゆるライブイメージングプロトコルの目標は、このような脱水や低酸素などの有害な影響を最小限に抑えることです。ライブイメージング解析のためのショウジョウバエの胚を調製するための以前のプロトコルは、ハロカーボンのオイルでdechorionated胚を配置し、ハロカーボンガス透過膜とカバーの間にそれらを挟む関与している
Protocol
準備
- 標準的なブドウジュース寒天プレート4の胚を収集する。それは自動化されたショウジョウバエの卵コレクタ（Flymax科学機器（株））を使用すると便利です。同期を使用すると、胚のコレクションが必要な発育段階で胚の適切な数値を得るために実行しなければならないdechorionationsの数を減らす予定上演。
- 顕微鏡のスライドに両面テープの一部を添付してdechorionationのスライドを準備する。テープから裏紙を取り外します。
- チャンバーのウェル中に収まるように組織片を切断することにより、ライブイメージング室を準備します。ウェル内の組織を配置し、蒸留水で濡らす。
- 1:1の比率でハロカーボンオイル（ハロカーボン製品社）粘度のシリーズ700とシリーズ56を混ぜる。混合物は、保存され、無期限に使用することができます。
- カバースリップ（22 X 40ミリメートル、第2号）の表面にハロカーボンオイルのいくつかの小滴を置きます。ボリュームは重要ではないが、20〜40μlの順で指定する必要があります。
手順
- 実体顕微鏡の助けを借りて、どちらかの宝石商のピンセット（5番）や非常に細かいペイントブラシを使用して、グレープジュース、寒天プレートから胚を回収する。胚は、相互に及び鉗子"のヒントに固執する傾向があり、それらは簡単にまとまって集まっている。
- 実体顕微鏡の助けを借りて、軽くdechorionationのスライド上のテープの表面に鉗子の先端に付着した胚の塊を下げる。
- 再び実体顕微鏡を使用して、静かに内側の卵黄膜（卵黄膜が破裂している場合胚がバーストされる）を破裂させずに外側のワックス状の絨毛膜を開いて打開するために鉗子の面で胚を揺らす事や脳卒中。
- 外側の絨毛膜が破裂した後は、絨毛膜から胚をいじめる。dechorionated胚は、鉗子の表面に付着する傾向があります。テープの表面にdechorionated胚を触れないように注意してください。
- とすぐに胚がdechorionatedなので、すぐにカバースリップ上にハロカーボンオイルの予め調製したドロップに移す。ハロカーボンの油滴の表面にdechorionated胚を運ぶ鉗子の先端をタッチして - これは石油に鉗子から胚をdislodges。
- 油滴の胚の転送を確認してください。これは、黒い背景上で動作し、斜めの角度で設定された光ファイバー照明の光源を使用していることが肉眼で行うことができます。
- 別の胚をdechorionateを試みる前に、鉗子から任意の油をきれいに。油でコーティングされた鉗子はdechorionationをより困難に、絨毛膜の表面上に小さいものがある。
- Dechorionated胚は、ハロカーボンのオイルで好調です。鉗子や絵筆を使用し、実体顕微鏡を通して見ながら、油滴の底面に胚を押してお好みのポジションに配置。
- すぐにライブイメージングチャンバーの優に超えるカバースリップを反転。胚は、所望の方向にカバースリップに対して休んでいることを確認してください。油で彼らの浮力のために、胚はカバースリップの下面に対してフロートします。テープでライブイメージング室にカバースリップを修正。テープがカバースリップの端とライブイメージングチャンバーのウェルの端との間のギャップにまたがる地域にテープで穴をカットすることによりチャンバーを換気する。
- 直立蛍光顕微鏡または蛍光実体顕微鏡は、現在のイメージ胚をするために使用することができます。
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Discussion
我々は、ハンギングドロッププロトコルを呼び出すのライブイメージング解析、のために、ショウジョウバエの胚を作製する新しい方法を説明します。残念ながら、それは倒立顕微鏡を扱う場合ハンギングドロッププロトコルを使用することはできません。このケースで挟み込む技術が（上記の抽象的で説明したように）使用され、胚の圧縮は、懸念のままする必要があります。
セルの形状とサイズは形態形成運動に関連付けられている力を計算するために測定される実験では、正立顕微鏡やハンギングドロッププロトコルの使用は減少し胚の圧縮に望ましいおかげです。また、ハンギングドロッププロトコルを使用して減少した胚の圧縮は、挟む技法は平らな表面を提示するのに対し、胚のラウンド、歪みのない表面を提示の結果を持っています。共焦点顕微鏡を使用する場合、それは、したがって、挟持方法対ハンギングドロッププロトコルを使用している場合（スタックごとにさらに多くのスライス）より広いZ -スタックを収集することが必要です。 Z -スタックあたりのスライス数の増加は、しかし、レーザーの励起に関連するすべての写真毒性または光退色としてだけでなく、収集時間が長くなります。明らかに、低下圧縮に関連する実験的な利点は、多少Z -スタック取得時間の増加によって相殺されている。 Z -スタックの取得時間の増加にもかかわらず、しかし、我々は、ハンギングドロッププロトコルを使用して、胚の優れた生存率を観察している。
ハンギングドロッププロトコルはまた、蛍光顕微鏡で胚の観察に限定され、これに入射すると放出される光の光路は、ライブイメージングチャンバーを通過しません。 DIC顕微鏡または他の非蛍光光学系を用いたライブイメージング胚を中断胚を介して凝縮器からの光パスを可能にするライブイメージングチャンバーを変更することによって達成することができる。
ハンギングドロップ法を用いての懸念は、望ましくない動作またはボックスに追加取得時の視野内の胚の"漂流"があります。逆カバースリップの下側に浮かぶときは、我々は、胚は非常に安定していると、乾燥や油浸対物のいずれかを使用するときの位置にシフトしていないことがわかります。電動顕微鏡ステージを使用してマルチポイントタイムラプス買収はまた、ハンギングドロッププロトコルを使用して調製される胚の位置が妨げられることはありません。ハンギングドロップ法を用いて作製した胚のあらゆる動きは、ハロカーボンの油滴のサイズを縮小し、その独立した油滴は、ライブイメージングチャンバーのウェルの縁に沿って融着またはウィッキングではない保証することによって除去することができます。
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Acknowledgments
我々は感謝ディスカバリーグラントだけでなく、研究ツールとカナダ自然科学工学研究評議会（NSERC）からインストゥルメントの助成金を介してBHRにサポートを認めます。我々はまた、H.織田と例のライブイメージングシーケンスで使用された遺伝資源を提供するためのブルーミントンショウジョウバエストックセンターを認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides | |||
| coverslips (22 x 40 mm, No. 2) | |||
| double-sided tape | |||
| jeweller’s forceps (Dumont style No. 5) | |||
| halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.) | |||
| a utility knife or single edge razor blade | |||
| tissue paper | |||
| scissors | |||
| distilled water | |||
| general purpose tape | |||
| a pipet suitable for delivering 20-40 μl. | |||
| The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required. | |||
References
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. , 248-2429 (2002).
- Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
- Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).
