Summary
Une méthode simple, peu coûteux et efficace de préparer les embryons de drosophile pour live-imagerie analyse est présentée. Notre protocole prévoit l'échange d'humidité et de gaz et ne compresse pas l'embryon de drosophile. Cette méthode est adaptée pour la GFP imagerie basée sur des embryons de drosophile direct en utilisant un stéréomicroscope ou microscope composé debout.
Abstract
Protéine fluorescente verte (GFP) basé timelapse vivons-imagerie est une technique puissante pour étudier la régulation génétique de processus dynamiques tels que la morphogenèse des tissus, adhérence cellule-cellule, ou la mort cellulaire. Embryons de drosophile exprimant la GFP sont facilement imagée en utilisant la microscopie soit stéréoscopique ou confocale. Un but de tout protocole vivons-imagerie est de minimiser les effets néfastes tels que la déshydratation et l'hypoxie. Protocoles antérieurs pour préparer des embryons de drosophile pour live-analyse de l'imagerie ont impliqué plaçant embryons dechorionated dans l'huile d'halocarbures et de les intercaler entre un halocarbure perméables au gaz de membrane et une lamelle
Protocol
Préparation
- Recueillir des embryons sur le standard des plaques d'agar jus de raisin 4. Il est commode d'utiliser un système automatisé de drosophile Egg Collector (flymax scientifique Equipment Ltd.) Utiliser synchrones en scène des collections embryon réduire le nombre de dechorionations qui doivent être effectuées afin d'obtenir un nombre suffisant d'embryons au stade désiré de développement.
- Préparer une diapositive dechorionation en attachant un morceau de scotch double-face à une lame de microscope, retirer la pellicule protectrice de la bande.
- Préparer la chambre de l'imagerie en direct par couper un morceau de tissu pour tenir dans le puits de la chambre. Placez le tissu dans le puits et le mouillé avec de l'eau distillée.
- Mélanger l'huile d'halocarbures (Halocarbon Products Corp) de la série 700 et série 56 de viscosité à un ratio de 1:1. Le mélange peut être stocké et utilisé indéfiniment.
- Placez plusieurs petites gouttes d'huile d'halocarbures sur la surface d'une lamelle (22 x 40 mm, n ° 2). Le volume n'est pas critique mais doit être de l'ordre de ul 20-40.
Procédure
- Avec l'aide d'un stéréomicroscope, recueillir des embryons à partir du raisin Jus-agar en utilisant soit une paire de pinces de bijoutier (n ° 5) ou d'un pinceau très fin. Les embryons ont tendance à coller les unes aux autres et à des conseils de la pince », ils sont facilement collectées en touffes.
- Avec l'aide d'un stéréomicroscope, abaissez doucement la touffes d'embryons qui ont adhéré à la pointe de la pince sur la surface de la bande sur la diapositive dechorionation.
- En utilisant à nouveau le stéréomicroscope, doucement pousser ou un AVC que les embryons avec le côté de la pince, afin de casser la chorion externe cireuse sans rupture de la membrane interne vitelline (l'embryon va éclater, si la membrane vitelline est rompue).
- Une fois le chorion externe a été rompue, taquiner l'embryon à partir du chorion, l'embryon dechorionated tend à adhérer à la surface de la pince. Prenez soin d'éviter de toucher l'embryon dechorionated à la surface de la bande.
- Dès que l'embryon n'est dechorionated, rapidement, il transfert à la baisse précédemment préparé de l'huile d'halocarbures sur la lamelle. Toucher la pointe de la pince transportant l'embryon dechorionated à la surface de la goutte d'huile sur les halocarbures - ce déloge l'embryon de la pince dans l'huile.
- Confirmer le transfert de l'embryon à la goutte d'huile. Cela peut être fait à l'œil nu à condition que vous travaillez sur un fond noir et d'utiliser une source d'illumination par fibre optique fixé à un angle oblique.
- Avant de tenter de dechorionate autre embryon, nettoyer toute l'huile de la pince. Pince enduit d'huile ont moins d'achat sur la surface du chorion, ce qui rend plus difficile dechorionation.
- Embryons sont porteurs Dechorionated dans l'huile d'halocarbures. En utilisant une pince ou d'un pinceau et tout en regardant à travers une loupe binoculaire, poussez l'embryon au fond de la goutte d'huile et l'organiser dans la position désirée.
- Vite inverser la lamelle sur le bien de la chambre de l'imagerie en direct. Confirmez que les embryons sont au repos contre la lamelle dans l'orientation désirée. En raison de leur flottabilité dans l'huile, les embryons seront désormais flotter contre la surface inférieure de la lamelle. Fixer la lamelle de la chambre de l'imagerie en direct avec du ruban adhésif. Aérer la chambre par des trous dans la bande dans la zone où la bande enjambe le fossé entre la fin de la lamelle et la fin du puits de la chambre de l'imagerie en direct.
- Un microscope à fluorescence verticale ou un stéréomicroscope à fluorescence peut maintenant être utilisé à l'image de l'embryon.
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Discussion
Nous décrivons une nouvelle méthode de préparation des embryons de drosophile pour l'analyse de l'imagerie en direct, que nous appelons le protocole goutte suspendue. Malheureusement, il n'est pas possible d'utiliser le protocole goutte suspendue si l'on travaille avec un microscope inversé. Dans ce cas, la technique sandwich (comme décrit ci-dessus dans le résumé) doivent être utilisées et la compression des embryons reste un sujet de préoccupation.
Dans les expériences où la forme des cellules et la taille sont mesurés afin de calculer les forces associées aux mouvements morphogénétiques, l'utilisation d'un microscope droit et le protocole de goutte suspendue est dû à la compression préférable d'embryon réduit. En outre, la compression réduit l'embryon en utilisant le protocole goutte suspendue a pour conséquence de présenter la surface ronde non déformée de l'embryon alors que la technique en sandwich présente une surface aplatie. Lorsque vous utilisez la microscopie confocale, il est donc nécessaire de recueillir un. Large Z-stack (plusieurs tranches par pile) lorsque vous utilisez le protocole goutte suspendue par rapport à la méthode de prise en sandwich L'augmentation du nombre de tranches par Z-stack, cependant, augmente le temps d'acquisition ainsi que toute photo-toxicité ou photo-blanchiment associé à une excitation laser. De toute évidence, le bénéfice expérimentale associée à la compression réduit est quelque peu compensée par une augmentation des temps d'acquisition Z-stack. Malgré cette augmentation dans le temps d'acquisition Z-stack, toutefois, nous avons observé une excellente viabilité des embryons en utilisant le protocole goutte suspendue.
Le protocole goutte suspendue est également limitée à l'observation des embryons par microscopie à fluorescence, dans lequel le chemin de la lumière de l'incident et la lumière émise ne passe pas par la chambre de vivre-imagerie. Live-imagerie par microscopie DIC embryons ou d'autres non-fluorescence optique pourrait être atteint en modifiant la chambre vivons-imagerie afin de permettre un chemin de lumière provenant du condenseur à l'embryon en suspension.
Une préoccupation lors de l'utilisation de la technique goutte suspendue peut être le mouvement indésirable ou "dérive" des embryons dans le champ de vision lors de l'acquisition timelapse. Lorsque flottant contre le dessous de la lamelle inversé, nous constatons que les embryons sont remarquablement stables et ne changent pas de position lors de l'utilisation à sec ou des objectifs à immersion d'huile. Multipoint timelapse acquisition en utilisant une platine de microscope motorisé n'est pas non plus perturber les positions des embryons qui sont préparés en utilisant le protocole goutte suspendue. Tout mouvement d'embryons préparés en utilisant la technique du goutte suspendue peut être éliminé en réduisant la taille de la goutte d'huile d'halocarbures et de s'assurer que les gouttes d'huile ne sont pas séparés de fusion ou de mèche le long du bord de l'imagerie en direct de chambre est bien.
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Acknowledgments
Nous remercions le soutien à la BHR à travers une subvention à la découverte ainsi que d'un outils de recherche et Grant Instrument de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG). Nous reconnaissons également H. Oda et le stock de Bloomington drosophile Centre de fournir des stocks génétiques qui ont été utilisés dans des séquences d'imagerie par exemple la vivre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides | |||
| coverslips (22 x 40 mm, No. 2) | |||
| double-sided tape | |||
| jeweller’s forceps (Dumont style No. 5) | |||
| halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.) | |||
| a utility knife or single edge razor blade | |||
| tissue paper | |||
| scissors | |||
| distilled water | |||
| general purpose tape | |||
| a pipet suitable for delivering 20-40 μl. | |||
| The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required. | |||
References
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. , 248-2429 (2002).
- Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
- Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).
