Summary
Een eenvoudige, goedkope en effectieve methode voor de bereiding Drosophila embryo's voor live-imaging analyse wordt gepresenteerd. Onze-protocol zorgt voor vochtigheid en gas uit te wisselen en comprimeert niet de Drosophila embryo. Deze methode is geschikt voor het GFP-gebaseerde live beeldvorming van Drosophila embryo's met behulp van een stereomicroscoop of rechtop samengestelde microscoop.
Abstract
Groen fluorescerend eiwit (GFP)-gebaseerde timelapse live-imaging is een krachtige techniek voor het bestuderen van de genetische regulatie van dynamische processen zoals weefsel morfogenese, cel-cel adhesie, of celdood. Drosophila embryo's uitdrukken GFP zijn gemakkelijk beeld gebracht met behulp van stereoscopische of confocale microscopie. Een doel van een live-imaging protocol is het minimaliseren van nadelige effecten zoals uitdroging en hypoxie. Eerdere protocollen voor het bereiden van Drosophila embryo's voor live-imaging analyse hebben betrokken plaatsen dechorionated embryo's in halogene olie en daartussen ze tussen een halogene gas-permeabel membraan en een dekglaasje
Protocol
Voorbereiding
- Verzamel embryo's op standaard druivensap agarplaten 4. Het is handig om een geautomatiseerde Drosophila Egg Collector (flymax Scientific Equipment BV) te gebruiken. Met behulp van synchrone geënsceneerde embryo collecties zal het aantal dechorionations die moeten worden uitgevoerd om voldoende aantallen embryo's te verkrijgen bij de gewenste ontwikkelingsstadium te verminderen.
- Bereid een dechorionation dia door het aanbrengen van een stukje dubbelzijdige tape op een objectglaasje, verwijder de steun van de tape.
- De voorbereiding van de live-imaging kamer door het snijden van een stukje weefsel te passen in de put van de kamer. Plaats het weefsel in de put en nat met gedestilleerd water.
- Mix halogene olie (Halocarbon Products Corp) viscositeit serie 700 en serie 56 in een verhouding van 1:1. Het mengsel kan worden opgeslagen en voor onbepaalde tijd worden gebruikt.
- Plaats een aantal kleine druppels halogene olie op het oppervlak van een dekglaasje (22 X 40 mm, nr. 2). Het volume is niet kritisch, maar moet in de orde van 20-40 ul.
Procedure
- Met behulp van een stereomicroscoop, het verzamelen van embryo's uit het druivensap-agar platen met behulp van een paar van juwelier de pincet (nr. 5) of een zeer fijn penseel. Embryo's hebben de neiging vast te houden aan elkaar en aan de tang 'tips, ze zijn gemakkelijk te verzamelen in groepjes.
- Met behulp van een stereomicroscoop, voorzichtig lager de pollen van de embryo's die aan de uiteinden van de tang gehandeld op het oppervlak van de tape op de dechorionation dia.
- Opnieuw met behulp van de stereomicroscoop, zacht duwtje of een beroerte de embryo's met de zijkant van de tang, om open te breken de buitenste wasachtige chorion zonder open te barsten de binnenste vitelline membraan (het embryo zal barsten wanneer de vitelline membraan is gescheurd).
- Zodra de buitenste chorion is gescheurd, plagen het embryo uit het chorion, de dechorionated embryo heeft de neiging om zich aan het oppervlak van de tang. Zorg ervoor om te voorkomen dat het aanraken van de dechorionated embryo aan het oppervlak van de tape.
- Zodra een embryo dechorionated is, zo snel mogelijk in de vooraf bereide druppel halogene olie op het dekglaasje. Raak het uiteinde van de tang het dragen van de dechorionated embryo aan het oppervlak van de halogene oliedruppel - dit loskomt het embryo uit de tang in de olie.
- Bevestigen dat de overdracht van het embryo om de olie te laten vallen. Dit kan gedaan worden met het blote oog op voorwaarde dat je werkt op een zwarte achtergrond en het gebruik van een glasvezel-verlichting bron ingesteld op een schuine hoek.
- Voordat u probeert om een ander embryo dechorionate, schoon geen olie uit de tang. Pincet gecoat in olie minder te kopen op het chorion oppervlak, waardoor dechorionation moeilijker.
- Dechorionated embryo's worden drijfvermogen in de halogene olie. Met behulp van een tang of een penseel en terwijl u door middel van een stereomicroscoop, het embryo druk aan de onderkant van de olie te laten vallen en regelen in de gewenste positie.
- Snel omdraaien van de dekglaasje over de bron van de live imaging kamer. Bevestigen dat de embryo's rusten tegen de dekglaasje in de gewenste richting. Door hun drijfvermogen in de olie, zal de embryo's zweven nu tegen de onderkant van het dekglaasje. Bevestig de dekglaasje naar de live imaging kamer met tape. Ventileer de kamer door te snijden gaten in de tape in het gebied waar de tape overspant de kloof tussen het einde van de dekglaasje en het einde van de bron van de live imaging kamer.
- Een rechtopstaande fluorescentie microscoop of een fluorescentie stereomicroscoop kan nu gebruikt worden om het imago van de embryo's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beschrijven we een nieuwe methode voor het bereiden Drosophila embryo's voor live-imaging-analyse, die we de opknoping druppel protocol. Helaas is het niet mogelijk om de opknoping druppel protocol te gebruiken bij het werken met een omgekeerde microscoop. In dit geval de daartussen techniek (zoals beschreven in de samenvatting hierboven) moet worden gebruikt en compressie van de embryo's blijft een punt van zorg.
In experimenten waar de cel vorm en grootte worden gemeten om krachten die met morfogenetische beweging te berekenen, het gebruik van een rechtopstaande microscoop en de opknoping druppel protocol is te verkiezen als gevolg van verminderde embryo compressie. Ook verminderde embryo compressie met behulp van de opknoping druppel protocol is het gevolg van de presentatie van de ronde, onvervormde oppervlak van het embryo terwijl de daartussen techniek presenteert een platte oppervlak. Bij het gebruik van confocale microscopie is het daarom noodzakelijk te verzamelen om een bredere Z-stack (meer schijfjes per stack) bij het gebruik van de opknoping druppel protocol ten opzichte van de daartussen methode. De toename van het aantal plakjes per Z-stack, maar wel een toename acquisitie tijd evenals een foto-toxiciteit of foto-bleken geassocieerd met laser excitatie. Het is duidelijk dat de experimentele voordeel geassocieerd met een verminderde compressie enigszins gecompenseerd door een toename van de Z-stack overname tijden. Ondanks deze toename van de Z-stack acquisitie tijd, echter, hebben we geconstateerd uitstekende levensvatbaarheid van embryo's met behulp van de opknoping druppel protocol.
De opknoping druppel protocol is eveneens beperkt tot de observatie van embryo's door middel van fluorescentie microscopie, waarin het licht weg van de incident-en uitgezonden licht niet door de live-imaging kamer. Live-imaging embryo's met behulp van DIC microscopie of andere niet-fluorescentie optiek kan worden bereikt door aanpassing van de live-imaging kamer naar een lichtpad toestaan van de condensor door middel van de geschorste embryo.
Een zorg bij het gebruik van de opknoping druppel techniek kan ongewenste bewegingen of "drifting" van embryo's in het gezichtsveld tijdens timelapse acquisitie. Als drijvende tegen de onderzijde van de omgekeerde dekglaasje, vinden we dat de embryo's opmerkelijk stabiel zijn en geen verschuiving in de stand bij het gebruik van de droge of de olie-immersie doelstellingen. Multipoint timelapse acquisitie met behulp van een gemotoriseerd microscoop stadium ook niet verstoort de posities van embryo's die zijn bereid met behulp van de opknoping druppel protocol. Elke beweging van embryo's opgesteld op basis van de opknoping druppel techniek kan worden geëlimineerd door het verminderen van de grootte van de halogene olie dalen en ervoor te zorgen dat afzonderlijke oliedruppels niet smelten of wicking langs de rand van de live-imaging kamer is goed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij dankbaar erkennen steun aan BHR door middel van een Discovery Grant als een research tools en Instrument Grant van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (NSERC). Erkennen wij ook H. Oda en de Bloomington Drosophila voorraad Centrum voor het aanbieden van genetische aandelen die werden gebruikt in het voorbeeld live-imaging sequenties.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides | |||
| coverslips (22 x 40 mm, No. 2) | |||
| double-sided tape | |||
| jeweller’s forceps (Dumont style No. 5) | |||
| halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.) | |||
| a utility knife or single edge razor blade | |||
| tissue paper | |||
| scissors | |||
| distilled water | |||
| general purpose tape | |||
| a pipet suitable for delivering 20-40 μl. | |||
| The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required. | |||
References
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. , 248-2429 (2002).
- Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
- Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).
