Summary
라이브 영상 분석을위한 Drosophila의 배아를 준비, 간단한 저렴하고 효과적인 방법이 제공됩니다. 우리 프로토콜은 습도와 가스 교환을 제공하고 Drosophila의 배아를 압축하지 않습니다. 이 방법은 stereomicroscope 또는 수직 복합 현미경을 사용하여 Drosophila의 배아의 GFP 기반의 라이브 영상에 적합합니다.
Abstract
그린 형광 단백질 (GFP) timelapse 라이브 영상 그러한 조직 morphogenesis, 세포 - 세포 부착, 또는 세포 사망과 같은 동적 프로세스의 유전자 조절을 연구위한 강력한 기법입니다 기반. GFP를 표현 Drosophila의 배아는 즉시 중 입체 또는 공촛점 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다. 살아있는 영상 프로토콜의 목표는 탈수와 hypoxia로 해로운 영향을 최소화하는 것입니다. 라이브 영상 분석을위한 Drosophila의 배아를 준비 이전 프로토콜 할로 카본의 기름에 dechorionated 배아를 삽입하고 할로 카본 가스 투과 막과 coverslip 사이에 그들을 sandwiching 참여했습니다
Protocol
준비
- 표준 포도 - 쥬스 한천 플레이트 4 배아를 수집합니다. 그것은 자동 Drosophila 에그 콜렉터 (Flymax 첨단 장비 회사)를 이용하시면 편리합니다. 동기를 사용하면 배아 컬렉션 원하는 발달 단계에서 배아의 충분한 숫자를 얻기 위해 수행되어야합니다 dechorionations의 수를 줄일 수 있습니다 개최.
- 현미경 슬라이드에 양면 테이프의 조각을 부착하여 dechorionation 슬라이드를 준비하며 테이프에서지지를 제거합니다.
- 챔버의 잘 적응하기 위해 조직의 일부를 절단하여 라이브 영상 챔버를 준비합니다. 우물에 조직을 넣고 증류수로 젖었어.
- 1시 1분의 비율로 혼합 할로 카본 오일 (할로 카본 제품 주식 회사) 점도 시리즈 700 및 시리즈 56. 혼합물은 저장하고 무기한 사용할 수 있습니다.
- coverslip (22 X 40mm, 제 2)의 표면에 할로 카본 오일의 여러 작은 방울을 넣으십시오. 볼륨 중요한 것은 아니지만 20-40 μl의 순서에 있어야합니다.
절차
- stereomicroscope의 도움으로 중 보석의 포셉 한 쌍의 (제 5) 또는 아주 좋은 페인트 브러쉬를 사용하여 포도 주스 - 한천 플레이트에서 배아를 수집합니다. 배아는 서로와 포셉 '팁에 충실하는 경향이, 그들은 쉽게 대단히 짧은 시간에 모여 있습니다.
- stereomicroscope의 도움으로 부드럽게 dechorionation 슬라이드에있는 테이프의 표면에 포셉의 조언을 준수해야 태아의 대단히 짧은 시간을 낮추십시오.
- 다시 stereomicroscope를 사용하여 부드럽게 안쪽 vitelline 막 (vitelline 막이 터진 경우 배아가 파열됩니다) rupturing없이 외부 밀랍 chorion을 열고 침입하기 위해 포셉의 측면으로 배아를 슬쩍 찌르다 또는 뇌졸중.
- 외부 chorion가 파열되면 chorion에서 배아를 애타게, dechorionated 배아는 포셉의 표면을 준수하는 경향이있다. 테이프의 표면에 dechorionated 배아를 만지지 않도록 조심 해요.
- 마자 배가 dechorionated이므로, 빨리 coverslip에 할로 카본 오일의 이전 준비 드롭로 전송할 수 있습니다. 할로 카본 오일 드롭의 표면에 dechorionated 배아를 가지고 포셉의 팁을 터치 - 이것은 기름에 포셉에서 배아를 dislodges.
- 오일 드롭 배아의 전송을 확인합니다. 이것은 당신이 검정색 배경을 통해 업무와 경사 각도에서 설정 광섬유 조명 소스를 사용하는 제공된 육안으로 수행할 수 있습니다.
- 다른 배아를 dechorionate하기 전에, 포셉로부터 기름을 청소하십시오. 기름에 코팅 집게는 dechorionation 더 어렵게 chorion 표면에 적은 구입했습니다.
- Dechorionated 배아는 할로 카본 기름에 부력이 있습니다. 포셉 또는 페인트를 사용하고 stereomicroscope를 통해 보는 동안, 오일 드롭의 하단에 배아를 밀고하고 원하는 위치에 배열.
- 신속 라이브 이미징 챔버 잘 통해 coverslip을 반전. 태아가 원하는 방향으로 coverslip에 대한 쉬고 있는지 확인합니다. 기름에서 부력으로 인해 태아는 이제 coverslip의 낮은 표면으로부터 떠 것입니다. 테이프와 라이브 이미징 챔버로 coverslip을 수정. 테이프가 coverslip의 끝에와 라이브 이미징 챔버 잘의 끝 사이의 간격을 펼쳐져있는 지역의 테이프에 구멍을 절단하여 챔버를 환기.
- 직립 형광 현미경 또는 형광 stereomicroscope 이제 이미지 배아를 사용할 수 있습니다.
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Discussion
우리는 우리가 매달려 드롭 프로토콜을 호출 라이브 영상 분석에 대한 Drosophila의 배아를 준비하는 새로운 방법을 설명합니다. 불행히도, 거꾸로 현미경으로 작업하는 경우 매달려 놓기 프로토콜을 사용하는 것은 불가능합니다. 이 경우에는 sandwiching 기술은 (같은 추상적 위에서 설명한) 사용하고 배아의 압축 우려 남아 있어야합니다.
세포 모양과 크기가 morphogenetic 운동과 관련된 세력을 계산하기 위해 측정 실험에서, 똑바로 현미경 및 매달려 드롭 프로토콜의 사용은 감소 배아 압축 것이 바람직 때문에입니다. 또한, 매달려 드롭 프로토콜을 사용하여 감소 배아 압축 sandwiching 기술이 평평 표면을 제시 반면 배아의 둥근 undistorted 표면을 표현의 결과가 있습니다. 공촛점 현미경을 사용하면 그것이 수집 그러므로 필요한 sandwiching 방법 대 매달려 드롭 프로토콜을 사용하는 경우 (스택 당 조각) 광범위한 Z - 스택. Z - 스택 당 조각의 증가 숫자는, 그러나, 레이저 여기와 관련된 모든 사진 독성 또는 사진 - 표백뿐 아니라 수집 시간을 증가시킵니다. 확실히 감소 압축과 관련된 실험 혜택은 다소 Z - 스택 수집 시간의 증가에 의해 상쇄됩니다. Z - 스택 수집 시간이 증가에도 불구하고, 그러나, 우리는 매달려 드롭 프로토콜을 사용하여 배아 우수 생존을 관찰했습니다.
매달려 드롭 프로토콜은 또한 사고와 방출되는 빛의 조명 경로 라이브 영상 챔버를 통과하지 않는있는 형광 현미경에 의해 태아의 관찰로 제한됩니다. DIC 현미경 또는 기타 비 형광 광을 사용하여 라이브 영상 태아가 중단 배아를 통해 콘덴서에서 조명 경로를 허용하는 라이브 영상 챔버를 수정하여 얻을 수 있습니다.
매달려 드롭 기법을 사용하는 우려가 원하지 않는 움직임이나 timelapse 수집 중보기의 분야에서 배아의 "표류"가 될 수 있습니다. 거꾸로 coverslip의 아래쪽에 대해 부동 때, 우리는 배아는 매우 안정하고 건조하거나 기름 침지 목표 중 하나를 사용하는 경우 위치 이동하지 찾습니다. 전동 현미경 스테이지를 사용하여 Multipoint timelapse 획득도 매달려 드롭 프로토콜을 사용하여 준비가되어 태아의 위치를 중단하지 않습니다. 매달려 드롭 기법을 사용하여 준비 태아의 움직임은 할로 카본 오일 드롭의 크기를 줄이고 그 별도의 기름 방울이 라이브 영상 챔버 웰의 가장자리를 따라 융합 또는 위킹 없습니다함으로써 제거될 수 있습니다.
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Acknowledgments
우리는 기꺼이 디스커버리 그랜트뿐 아니라 연구 도구 및 자연 과학, 캐나다 공학 연구 협의회 (NSERC)에서 악기 부여를 통해 BHR 지원을 인정합니다. 또한 H.오다와 예제 라이브 영상 시퀀스에 사용되었습니다 유전 주식을 제공하는 블루밍턴 Drosophila 주식 센터를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides | |||
| coverslips (22 x 40 mm, No. 2) | |||
| double-sided tape | |||
| jeweller’s forceps (Dumont style No. 5) | |||
| halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.) | |||
| a utility knife or single edge razor blade | |||
| tissue paper | |||
| scissors | |||
| distilled water | |||
| general purpose tape | |||
| a pipet suitable for delivering 20-40 μl. | |||
| The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required. | |||
References
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. , 248-2429 (2002).
- Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
- Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).
