Summary
Um método simples, barato e eficaz de preparação de embriões de Drosophila live-imaging análise é apresentada. Nosso protocolo fornece umidade e as trocas gasosas e não comprimir o embrião de Drosophila. Este método é adequado para GFP baseada em imagens ao vivo de embriões Drosophila usando um estereomicroscópio ou microscópio composto vertical.
Abstract
Proteína fluorescente verde (GFP) baseado em timelapse ao vivo de imagens é uma técnica poderosa para estudar a regulação genética de processos dinâmicos como a morfogênese do tecido, célula-adesão, ou morte celular. Embriões Drosophila expressando GFP são prontamente fotografada usando um microscópio estereoscópico ou confocal. A meta de qualquer protocolo de live-imaging é minimizar efeitos negativos como a desidratação e hipóxia. Protocolos anteriores para preparar os embriões de Drosophila live-imaging análise envolveram a colocação de embriões dechorionated em óleo halocarbonos e imprensando-los entre um halocarbono gás-permeáveis membrana e uma lamela
Protocol
Preparação
- Coletar embriões em placas padrão suco de uva-agar 4. É conveniente usar um sistema automatizado de Drosophila Egg Collector (Flymax Scientific Equipment Ltd.). Usando síncrona encenado coleções embrião irá reduzir o número de dechorionations que devem ser executadas de modo a obter um número suficiente de embriões no estágio de desenvolvimento desejado.
- Prepare um slide dechorionation anexando um pedaço de fita dupla face a uma lâmina de microscópio; remover a proteção da fita adesiva.
- Prepare a câmara de imagens ao vivo, cortando um pedaço de tecido para caber no poço da câmara. Coloque o tecido no bem e molhe-a com água destilada.
- Mix halocarbono óleo (Halocarbon Products Corp) série 700 viscosidade e série 56 na proporção de 1:1. A mistura pode ser armazenada e usada indefinidamente.
- Coloque várias pequenas gotas de óleo de halocarbonos na superfície de uma lamela (22 X 40 mm, n º 2). O volume não é crítica mas deve ser da ordem de mL 20-40.
Procedimento
- Com o auxílio de um estereomicroscópio, coletar embriões a partir do suco de uva-ágar placas usando um par de fórceps joalheiro (n º 5) ou um pincel muito fino. Embriões tendem a ficar uns aos outros e às pontas do fórceps ", pois eles são facilmente reunidas em grupos.
- Com o auxílio de um estereomicroscópio, delicadamente abaixar a aglomerados de embriões que tenham aderido às pontas do fórceps na superfície da fita sobre o slide dechorionation.
- Novamente usando o estereomicroscópio, delicadamente nudge ou acidente vascular cerebral os embriões com o lado da pinça, a fim de romper o córion exterior waxy sem ruptura da membrana vitelina interna (o embrião vai estourar se a membrana vitelina é rompido).
- Uma vez que o córion exterior foi rompido, burlar o embrião a partir do córion; o embrião dechorionated tende a aderir à superfície do fórceps. Tome cuidado para evitar tocar o embrião dechorionated para a superfície da fita.
- Assim que um embrião é dechorionated, rapidamente transferi-lo para a queda previamente preparado de óleo de halocarbonos na lamela. Toque a ponta da pinça carregando o embrião dechorionated à superfície da gota de óleo halocarbono - este desaloja o embrião do fórceps no óleo.
- Confirmar a transferência do embrião para a queda do petróleo. Isto pode ser feito a olho nu, desde que você trabalha sobre um fundo preto e usar uma fonte de iluminação de fibra óptica fixado em um ângulo oblíquo.
- Antes de tentar dechorionate outro embrião, limpar todo o óleo do fórceps. Fórceps revestido em óleo têm menos compra na superfície córion, tornando dechorionation mais difícil.
- Embriões são Dechorionated flutuante no óleo halocarbonos. Utilizando uma pinça ou um pincel e durante a visualização através de um microscópio estereoscópico, empurre o embrião para o fundo da gota de óleo e organizá-lo na posição desejada.
- Rapidamente inverter a lamínula sobre o poço da câmara de imagens ao vivo. Confirmar que os embriões estão descansando contra a lamínula na orientação desejada. Devido à sua flutuabilidade no óleo, os embriões serão agora flutuar contra a superfície inferior da lamela. Fixar a lamínula para a câmara de imagens ao vivo com fita adesiva. Ventilar a câmara cortando buracos na fita na área onde a fita mede o intervalo entre a extremidade da lamela eo fim do poço da câmara de imagens ao vivo.
- Um microscópio de fluorescência na vertical ou um estereomicroscópio fluorescência agora pode ser usado para a imagem dos embriões.
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Discussion
Descrevemos um novo método de preparação de embriões Drosophila para análise de imagens ao vivo, que chamamos de protocolo de gota em suspensão. Infelizmente, não é possível usar o protocolo de gota em suspensão se trabalhar com um microscópio invertido. Neste caso, a técnica de sanduíche (como descrito acima no abstract) deve ser utilizado e compressão dos embriões permanece uma preocupação.
Em experimentos onde a forma da célula e tamanho são medidos para calcular forças associadas com o movimento morfogenético, o uso de um microscópio vertical eo protocolo de gota em suspensão é preferível devido à compressão embrião reduzida. Além disso, a compressão embrião reduzido utilizando o protocolo de gota em suspensão tem a consequência de apresentar a superfície arredondada e sem distorções do embrião enquanto a técnica sandwiching apresenta uma superfície plana. Quando se utiliza a microscopia confocal é, portanto, necessário para coletar uma. Amplo Z-stack (fatias mais por pilha) quando se utiliza o protocolo gotas de suspensão em relação ao método sandwiching O aumento do número de fatias por Z-stack, porém, aumenta o tempo de aquisição, bem como qualquer foto-toxicidade ou foto-branqueamento associada com excitação laser. Claramente, o benefício experimental associada à compressão reduzida é um pouco compensado por um aumento nos tempos de Z-stack aquisição. Apesar desse aumento de Z-stack tempo de aquisição, no entanto, temos observado excelentes viabilidade de embriões utilizando o protocolo de gota em suspensão.
O protocolo de gota em suspensão é também limitada à observação de embriões por microscopia de fluorescência, em que o caminho da luz incidente e da luz emitida não passem pela câmara ao vivo de imagens. Ao vivo de imagens-embriões utilizando microscopia DIC ou outros não-fluorescência óptica poderia ser alcançado através da modificação da câmara ao vivo de imagens para permitir um caminho de luz do condensador através do embrião suspenso.
Uma preocupação quando se utiliza a técnica de gota em suspensão podem ser movimentos indesejáveis ou "drifting" de embriões no campo de visão durante a aquisição timelapse. Quando flutuando contra a parte inferior da lamela invertida, descobrimos que os embriões são extremamente estáveis e não mudança de posição quando se usa seco ou objetivos de imersão em óleo. Multiponto aquisição timelapse usando um estágio do microscópio motorizado também não atrapalhar as posições de embriões que são preparadas usando o protocolo de gota em suspensão. Qualquer movimento de embriões preparados utilizando a técnica de gota em suspensão pode ser eliminada, reduzindo o tamanho da gota de óleo halocarbonos e garantir que gotas de óleo em separado não são de fusão ou absorção ao longo da borda da câmara ao vivo de imagens está bem.
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Acknowledgments
Agradecemos o apoio de HB através de um Grant Descoberta, bem como um instrumentos de pesquisa e Grant Instrumento das Ciências Naturais e Engenharia pesquisas Council of Canada (NSERC). Reconhecemos também H. Oda eo Bloomington Drosophila ações Centro para a prestação de estoques genéticos que foram usadas no exemplo sequências de imagens ao vivo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides | |||
| coverslips (22 x 40 mm, No. 2) | |||
| double-sided tape | |||
| jeweller’s forceps (Dumont style No. 5) | |||
| halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.) | |||
| a utility knife or single edge razor blade | |||
| tissue paper | |||
| scissors | |||
| distilled water | |||
| general purpose tape | |||
| a pipet suitable for delivering 20-40 μl. | |||
| The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required. | |||
References
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. , 248-2429 (2002).
- Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
- Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).
