Summary
Drosophila embriyolar canlı görüntüleme analizi hazırlama, basit, ucuz ve etkili bir yöntem sunulmuştur. Bizim protokol nem ve gaz değişimi sağlar ve Drosophila embriyo sıkıştırmak değil. Bu yöntem, GFP tabanlı bir stereomikroskopta ya da dik bileşik mikroskop kullanarak Drosophila embriyoların canlı görüntüleme için uygundur.
Abstract
Yeşil floresan proteini (GFP) timelapse canlı görüntüleme, doku morfolojilerinden, hücre-hücre adezyon veya hücre ölümü gibi dinamik süreçlerin genetik düzenleme çalışmak için güçlü bir tekniktir tabanlı. Drosophila embriyolar ifade GFP kolayca ya stereoskopik veya konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülü. Herhangi bir canlı görüntüleme protokolü amacı, dehidratasyon ve hipoksi gibi zararlı etkileri en aza indirmek için. Drosophila embriyolar canlı görüntüleme analiz için hazırlanması için Önceki protokolleri Halokarbon yağ dechorionated embriyolar yerleştirme ve bir Halokarbon gaz geçirgen zar ve bir lamel arasında sandviç yer var
Protocol
Hazırlık
- Üzüm suyu standart agar plaklarına 4 embriyo toplayın. Bu otomatik bir Drosophila Yumurta Collector (flymax Bilimsel Cihazlar Ltd.) Kullanmak için uygundur. Senkron kullanarak embriyo koleksiyonları istenilen gelişimsel aşamada yeterli sayıda embriyo elde etmek için yapılmalıdır dechorionations sayısını azaltacaktır düzenledi.
- Çift taraflı bant, bir mikroskop lamı bir parça takarak dechorionation slayt hazırlayın; bant desteğini kaldırmak.
- Odanın iyi uyacak şekilde bir parça doku keserek canlı görüntüleme odası hazırlayın. Iyi doku ve distile su ile ıslatın.
- 1:1 oranında karıştırın Halokarbon yağı (Halokarbon Ürünleri A.Ş.) viskozite serisi 700 ve 56 serisi. Karışım saklanır ve süresiz kullanılabilir.
- Lamel (22 X 40 mm, No: 2) yüzey üzerinde birkaç küçük damla Halokarbon yağı koyun. Hacmi önemli değildir ama 20-40 ul sipariş olmalıdır.
Prosedür
- Jeweler forseps ya (5) sayılı bir çift veya çok ince bir boya fırçası kullanarak üzüm suyu agar plaklarına bir stereomikroskopta yardımı ile embriyolar toplamak. Embriyolar birbirlerine ve forseps ipuçları sopa eğilimindedir; kolayca yığınlarda toplanmıştır.
- Bir stereomikroskopta yardımı ile hafifçe düşük forseps ipuçları dechorionation slayt bant yüzeye yapıştırılır embriyoların yığınları.
- Yine stereomikroskopta kullanarak, yavaşça iç vitellin membran (vitellin membran rüptüre ise embriyo patlaması) çatlaması olmaksızın dış mumlu koryon açık kırmak için forseps yan embriyoların dürtmek veya inme.
- Dış koryon rüptüre edildikten sonra, koryon embriyo tease dechorionated embriyo forseps yüzeye yapışma eğilimi. Dechorionated embriyo bant yüzeyine dokunmaktan kaçının dikkat edin.
- En kısa sürede bir embriyo dechorionated olduğu gibi, lamel Halokarbon petrol önceden hazırlanmış damlasına kadar hızlı bir şekilde aktarın. Halokarbon yağ damlası yüzey dechorionated embriyo taşıyan forseps ucu Touch - bu yağın içine forseps embriyo püskürmesi.
- Yağ damlası embriyo transferi onaylayın. Bu siyah bir arka plan üzerinde çalışmak ve eğik bir açıyla fiber optik aydınlatma kaynağı kullanmak çıplak göz ile yapılabilir.
- Denemeden önce başka bir embriyo dechorionate için herhangi bir yağ, forseps temizleyin. Petrol kaplı Forseps dechorionation daha zor hale koryon yüzeyinde daha az satın alma var.
- Dechorionated embriyolar Halokarbon yağ içinde yüzen. Forseps veya bir fırça kullanma ve bir stereomikroskopta izlerken, yağ damlası alt embriyo itin ve istenilen pozisyona düzenlemek.
- Canlı görüntüleme odasının çok üzerinde lamel hızla çevirin. Embriyoların istenilen yönde lamel karşı dinlenme olduğunu onaylayın. Yağı kaldırma kuvveti nedeniyle embriyoların lamel alt yüzeyi karşı yüzer. Lamel canlı görüntüleme odasına bant ile sabitleyin. Bant sonu ve canlı görüntüleme odasının iyi lamel arasındaki boşluğu kapsadığı alan kaset delik keserek odasına havalandırınız.
- Dik bir floresan mikroskop ya da floresan stereomikroskopta embriyoların görüntü için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz asılı damla protokol dediğimiz canlı görüntüleme analizi, Drosophila embriyolar hazırlarken yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Ne yazık ki, ters bir mikroskop ile çalışıyorsanız asılı damla protokolünü kullanmak mümkün değildir. Bu durumda sandviç tekniği (soyut yukarıda açıklandığı gibi) ve embriyoların sıkıştırma bir sorun olmaya devam ediyor olması gerekir.
Morfogenetik hareketi ile ilişkili güçleri hesaplamak için, hücre şekli ve büyüklüğü ölçülür deneylerde, dik bir mikroskop ve asılı damla protokol kullanımı, daha az embriyo sıkıştırma tercih nedeniyle. Ayrıca, daha az embriyo sıkıştırma asılı damla protokolü kullanılarak sandviç tekniği düzleştirilmiş bir yüzey sunar ise, embriyo yuvarlak, bozulmamış yüzey sunulması sonucu vardır. Konfokal mikroskopi kullanılarak zaman toplamak için, bu nedenle gerekli bir sandviç yöntemi karşısında asılı damla protokolünü kullanarak (yığını başına daha çok dilim) daha geniş Z-yığını. Z-stack başına dilim artan sayıda, ancak, lazer uyarma ile ilgili herhangi bir fotoğraf toksisite ya da fotoğraf beyazlatma olarak alma süresi de artar. Açıkçası, düşük sıkıştırma ile ilgili deneysel bir yarar Z-yığın satın alma zamanlarda bir artış biraz dengelenir. Ancak Z-yığını edinimi süresi bu artışa rağmen, biz asılı damla protokolünü kullanarak mükemmel embriyo canlılığı gözlemledik.
Asılı damla protokolü aynı zamanda, olay ve yayılan ışık ışık yolu canlı görüntüleme odasının geçmez hangi floresan mikroskobu, embriyoların gözlem ile sınırlıdır. DIC mikroskopi veya diğer non-floresan optikler kullanılarak Canlı görüntüleme embriyolar askıya embriyo ile kondansatör bir ışık yolu izin vermek için canlı görüntüleme odasının değiştirerek elde edilebilir.
Asılı damla tekniği kullanılarak bir endişe istenmeyen hareket ya da görüş alanında timelapse satın alma sırasında embriyoların "sürüklenen" olabilir. Ters lamel alt karşı yüzen, embriyoların belirgin istikrarlı ve kuru veya immersiyon yağı hedeflerine kullanarak pozisyon geçiş bulabilirsiniz. Çok timelapse motorlu bir mikroskop sahne kullanarak satın alma aynı zamanda asılı damla protokolü kullanılarak hazırlanmış pozisyonlar embriyoların bozmamaktadır. Asılı damla tekniği kullanılarak hazırlanmış herhangi bir hareket embriyoların Halokarbon yağ damlası boyutunu azaltarak ve ayrı yağ damlacıkları canlı görüntüleme odasının iyi kenarı boyunca fırınlama veya esneklik değildir sağlayarak ortadan kaldırılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz minnetle Discovery Hibe yanı sıra, Kanada Doğal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Araştırma Araçları ve Çalgı Hibe yoluyla BHR destek kabul ediyorsunuz. Ayrıca H. Oda ve örnek canlı görüntüleme sekansları kullanıldı genetik stokları sağlamak için Bloomington Drosophila stok Center kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides | |||
| coverslips (22 x 40 mm, No. 2) | |||
| double-sided tape | |||
| jeweller’s forceps (Dumont style No. 5) | |||
| halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.) | |||
| a utility knife or single edge razor blade | |||
| tissue paper | |||
| scissors | |||
| distilled water | |||
| general purpose tape | |||
| a pipet suitable for delivering 20-40 μl. | |||
| The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required. | |||
References
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. , 248-2429 (2002).
- Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
- Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).
