Summary
Le système nerveux stomatogastric (STNS) du crabe nordique (
Abstract
Le ganglion stomatogastric (STG) est un excellent modèle pour étudier les interactions cellulaires et le réseau, car il contient un nombre relativement restreint de cellules (environ 25 en C. borealis) qui sont bien caractérisés. Les cellules de la STG présentent un large éventail de sorties et sont responsables de l'action motrice de l'estomac. L'estomac contient le moulin gastrique qui décompose les aliments avec trois dents internes, et le pylore qui filtre la nourriture avant qu'elle atteigne l'intestin moyen. Le STG produit deux sorties rythmiques pour contrôler le moulin gastrique et le pylore connue en tant que générateurs motif central (GPC). Chaque cellule dans la STG peuvent participer à l'une ou l'autre de ces rythmes. Ces GPC permettre l'étude de la neuromodulation, l'homéostasie, la variabilité cellulaire et réseau, développement du réseau, et la reprise du réseau.
La dissection du système nerveux stomatogastric (STNS) du crabe nordique (Cancer borealis) se fait en deux parties: la dissection fine et globale. Dans la dissection brute de l'estomac entier est disséqué du crabe. Pendant la dissection fines du STNS est extraite de l'estomac à l'aide d'un microscope de dissection et de micro-dissection des outils (voir figure 1). Le STNS comprend les STG, le ganglion œsophagien (OG), et les ganglions commissuraux (CG) ainsi que les nerfs qui innervent les muscles du ventre. Ici, nous montrons comment effectuer une dissection complète de l'STNS en préparation pour une expérience électrophysiologie où les cellules dans la STG seraient enregistrées à partir intracellulaire et les nerfs périphériques seraient utilisées pour des enregistrements extracellulaires. La bonne technique pour trouver les nerfs désirée est affichée, ainsi que notre technique de dégainage le ganglion de révéler le soma et le neuropile.
Protocol
1. Dissection brut
- Placer un crabe sur la glace pendant 30 minutes pour ternes les systèmes sensoriels et moteurs de l'animal. L'entourent sur tous les côtés avec de la glace. Les gants doivent être portés lors de la manipulation du crabe.
- Préparez-vous à la dissection brute en posant la poêle dissection et les outils que vous allez utiliser. Rongeurs, os de coupe ciseaux, petits ciseaux, pince à griffes, une spatule avec un bord effilé, un noir Sylgard revêtement plat, et les broches d'insectes sont nécessaires.
- Retirer le crabe du seau à glace par sa patte arrière pour l'empêcher de pincement et le placer dans la casserole de dissection.
- Retirez les premières griffes en tournant chacun vers l'intérieur. Ensuite, retirer chaque jambe en utilisant le mouvement de torsion même.
- Utilisation de la pince gouge, retirez le maxillaire se couvrir la bouche. Retirez également la maxillule doux.
- Utilisation de la pince gouge à nouveau, à partir de l'extrémité latérale postérieure de la carapace et obtenir une bonne adhérence sur le bord de celui-ci. Etouffer les rongeurs et de briser ce morceau de la carapace hors tension. Prendre soin d'enlever la carapace assez pour permettre à la spatule pour entrer dans l'ouverture. Continuez à supprimer le bord de la carapace jusqu'aux yeux et répétez de l'autre côté.
- Avec le côté effilé de la spatule, grattez délicatement le tissu mou intérieure loin du toit de la carapace dorsale. Gardez la spatule en contact avec la carapace pour éviter d'endommager l'STNS. Utilisez la pince gouge à rompre avec les parties de la carapace qui ont été séparés du tissu. Également séparer certains des tissus mous de la carapace ventrale en prenant soin de séparer les muscles adducteurs attacher le tissu de la carapace.
- Rompre la carapace dorsale postérieure autant que le cœur, où il ya deux petits osselets en saillie de la carapace. Coupez aussi loin que possible antérieure. Stabiliser le céphalon (le «visage») avec un doigt tout en rompant avec les parties les plus antérieure de la carapace dorsale.
- Sur la face ventrale de la carapace, tirez celui mandibules à la fois par l'ancrage de la pince gouge sur une mandibule, tordant leur extérieur pour déloger la mandibule de l'épistome attaché, et l'écartant. Deux longues osselets avec les muscles doivent être joints à la mandibule extraite si c'est fait correctement.
- Écartent le tissu sur les côtés du céphalon près des yeux à l'aide de la spatule. Avec des ciseaux de dissection petit coupé à travers le tissu le plus près de la crête de osselet comme couche par couche possibles.
- Reste le crabe contre une paroi de la casserole de dissection et le soutenir en le fixant en place (les griffes peut être utilisé pour cela). Couper le labrum ("lèvre supérieure") de l'épistome veillant à ne laisser aucun tissu attaché. L'utilisation d'os de coupe ciseaux faire deux coupes en diagonale dans la carapace ventrale pour enlever le céphalon.
- Prenez le labrum avec une pince à dents et couper la lèvre ("lèvre inférieure") loin de l'osselet sur la face ventrale. Puis soulevez doucement la lèvre loin de la carapace ventrale restantes. Utilisez des ciseaux petits de séparer la partie ventrale de l'estomac du tissu tapissant la carapace. Lorsque les ampoules pyloriques sont visibles, couper l'estomac loin de le tissu de chaque côté de celui-ci jusqu'à ce que l'estomac est extraite du crabe.
- Tout en maintenant l'estomac par la lèvre avec une pince, le repos de l'estomac contre la paume de la main et versez une solution saline dans la bouche. Cela élargit l'estomac et le rend plus facile à ciel ouvert. Couper de l'ouverture à la bouche vers le bas entre le droit du pylore travers l'osselet entre les ampoules. Puis couper en diagonale vers le bas par les deux branches cardiaques. Coupez les pointes des trois dents à l'intérieur de l'estomac.
- Placez le ventre sur une grande, noir, Sylgard revêtement plat avec l'intérieur de l'estomac vers le bas. Pin bas des cinq coins de la préparation avec des épingles d'insectes et de remplir le plat avec une solution saline froide, plongeant toute la préparation (voir figure 1).
2. Dissection fine
- , Micro-dissection sont les outils nécessaires pour la dissection fine. En particulier, pinces et de ciseaux à ressort sont nécessaires aussi bien en tant que titulaire broches avec une aiguille de tungstène. Un clair, Sylgard enduits, boîte de Pétri et des épingles fil fin devrait également avoir été préparé.
- Dès le grossissement le plus faible, commencez par mettre le doigt sur les rabats près de la lèvre qui l'habitude d'être l'ouverture bouche. Réorganiser le reste des broches pour faire la préparation tendue et la broche tous les autres secteurs nécessaires.
- Soulevez délicatement l'hypoderme repéré couvrant la partie inférieure de la préparation et la garniture en laissant dans un patch de l'hypoderme avec deux points blancs.
- Peler les jaunes, vaporeux, tissu membraneux près du fond de la préparation. Le mvns sont faiblement attaché à la face de ce tissu. Séparez délicatement l'mvns du tissu jaune comme il est tiré vers le haut. Suivez les tissus jaunes et coupé aux côtés du cerveau.
- Suivez le processus de sortie du cerveau d'épaisseur qui s'étendent laterally. Ce sont les nerfs commisural. Une fois l'extrémité du nerf commissural est atteinte, retirer la masse de spongieux, le tissu blanc cassé qui a été coupé du côté du cerveau.
- Lorsque les ions et fils rencontrent les Cogs, couper les tissus musculaires et de révéler la longueur des ions et des fils.
- Retour au patch hypoderme repéré et le couper. Ceci devrait laisser une ouverture de l'artère qui entoure la STG. Couper à travers l'ouverture de séparer les deux muscles qui entourent la STG. Soulever les extrémités de ces muscles et couper juste en dessous d'eux pour les séparer de l'artère et d'exposer les alns et AGNS. Séparez les muscles flanquant aussi loin que le cartilage couché sur le RTC.
- Coupez le tissu artériel autour de la STG jusqu'à l'endroit où l'mvns, DGN, et dvn rencontrer. Travailler le bas du DVN à l'LVNs et couper à travers l'blanchâtre, tissus délicats couvrant les LVNs.
- Localisez le psn sur l'osselet près du fond de la préparation. Le PSN peut être utilisé pour localiser les LVN et la jonction dlvn.
- Suivant suivre les dlvn bas pour localiser le PYN et PDN. Les enveloppements PYN souvent sur l'ampoule à l'ouverture du pylore. Le PDN bifurque de l'dlvn et est entre les pylorique ampoule et les muscles cardio pylore. Laissez un peu de muscle attaché à l'un de ces nerfs, car ils peuvent facilement être confondues lorsque la préparation est transférée à l'antenne claires Sylgard.
- Une fois que tous les nerfs ont été découverts, de rompre toute connexions restantes entre les STNS et les nerfs des tissus et non désirés de l'estomac. Soigneusement déplacer le STNS loin du reste de l'estomac, la coupe des correspondances manquées.
- Condition du plat Sylgard clair avec la masse restante des tissus de l'estomac en le frottant sur la surface de l'Sylgard jusqu'à ce que le Sylgard ne se sent plus trop collant ou sec. Sylgard est hydrophobe et la STNS adhèrent fortement à elle si le plat Sylgard revêtement n'est pas conditionnée de cette manière.
- Ajoutez un peu de solution saline froide à l'antenne. Prenez les extrémités supérieures des nerfs commissuraux avec des pinces et amener le STNS au plat claires Sylgard.
- Epingler la STNS bas sur le Sylgard. Sever le cerveau par les nerfs commissuraux et utiliser les broches Minuten pour sécuriser les quatre extrémités des rouages en premier lieu. Assurez-vous que la préparation est à l'endroit en vérifiant que le IVN est pointée vers le haut loin du Sylgard. La DGN doit sortir légèrement sous la STG lorsque la STG est du bon côté. Pin le reste du nerf se termine vers le bas avec les goupilles de fil fin.
- Nettoyez toute musculaires restantes ou les tissus de la STNS.
- Desheath le STG utilisant un support et une tige légèrement crochu, fine aiguille de tungstène,. Faire un petit trou dans un coin de la gaine STG loin du corps cellulaire et l'utilisation que le trou d'obtenir entre les couches de la gaine. Découpez soigneusement un rabat de la gaine séparée pour exposer le neuropile STG et les corps cellulaires.
- Pin toute volets de la gaine vers le bas pour augmenter l'accessibilité aux organes de la cellule et de stabiliser la STG pour les enregistrements intracellulaires. Re broches du reste de la STNS veillant à ce que chaque nerf est tendu et bien espacés pour l'enregistrement extracellulaire (voir figure 3).
3. Résultats
- Idéalement, toutes les nerfs doivent être libres d'entailles et des dommages, en particulier celles qui seront enregistrées à partir. Aucun des nerfs emmêlés devrait être ou tordu. Le STG doit être intact avec tous les cellules disposées dans une formation autour de la barbe neuropile. Le STNS intacte est bilatéralement symétrique et ressemble à un homoncule avec le LVNs que les jambes, le mvns que les armes et l'extrémité antérieure de la tête.
Abréviations:
| STNS | Stomatogastric du système nerveux |
| STG | Ganglionnaires Stomatogastric |
| CoG | Ganglionnaires commissurales |
| OG | Ganglion œsophagien |
| mvn | Nerf médian du ventricule |
| ions | Inférieur nerf oesophagien |
| le fils | Supérieur nerf oesophagien |
| AGN | Nerveuses antérieures gastriques |
| aln | Antérieur nerf sciatique |
| dgn | Dorsale du nerf gastrique |
| dvn | Nerf dorsal du ventricule |
| LVN | Nerveuses du ventricule latéral |
| psn | Nerveuses estomac postérieur |
| PYN | Nerveuses pylorique |
| pdn | Nerf dilatateur pylorique |
| dlvn | Branche dorsale du nerf du ventricule latéral |
| IVN | Nerveuses ventriculaires inférieures |
Figure 1: Schéma illustrant le placement approximatif de la STNS dans l'estomac avant de dissection.
Figure 2: Schéma des différents muscles dans la partie inférieure de l'estomac et une superposition des STNS en vert clair. Chaque type de cellule dans la STG est répertorié avec les muscles, ils sont connus pour innerver. Cette carte est utile pour la planification de disséquer un nerf qui transporte un signal provenant d'une cellule donnée (avec la permission du laboratoire de Nadim).
Figure 3: Schéma de l'STNS avec des électrodes intracellulaires et extracellulaires puits (de Marder et Bucher, 2007).
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Discussion
La dissection STNS est la première étape dans l'exécution d'une expérience ou électrophysiologie immunohistochimie, ou pour obtenir des cellules pour la culture cellulaire. Indépendamment de l'expérience prévue, la dissection brute restera inchangée. Cependant, la dissection fine peut varier. Il est important de planifier à l'avance du temps que les cellules des nerfs et qui vous enregistrer. La plupart des neurones dans la STG ont des processus qui innervent les muscles au moins un dans l'estomac (voir figure 2) et sont classés en fonction de leur cible innervée. Par conséquent, les enregistrements extracellulaires sont nécessaires pour bien vérifier l'identité d'une cellule qui est en cours d'enregistrement intracellulaire. Le rythme de fréquence du pylore et la robustesse sont utilisés pour surveiller la santé de la préparation. Par conséquent, de nombreuses expériences comprennent des enregistrements extracellulaires de la LVN. La DGN est couramment utilisé pour surveiller le rythme gastrique. Les STN est souvent cruciale pour la plupart des expériences, car il ya des cellules modulatrices nombreuses dans la partie antérieure du STNS et sectionnant ce nerf peut causer des rythmes pylorique et gastrique de cesser ou devenir irrégulier.
Même si l'ordre dans lequel les étapes de la dissection fine sont faite n'est pas important, il nous est facile de retirer le STNS sans dommage en gardant les extrémités des nerfs périphériques ancré au muscle qu'après la STG a été déconnecté du environnantes tissulaire. Ceci maintient la STG et assez tendue STN en toute sécurité et facilement supprimer les muscles et les tissus qui les entourent.
Une fois la préparation dans le plat claires Sylgard, tout tissu qui reste sur le STNS doivent être enlevés pour éviter l'interférence avec les électrodes pendant une expérience. Il est également plus facile d'obtenir de bons, des enregistrements stables lorsque la préparation est épinglé aussi tendu que possible sans causer de dommages aux nerfs. Il est particulièrement important que les STG être épinglé solidement par le alns avec des épingles courtes pour fournir l'accès aux électrodes intracellulaires autant de cellules que possible. Il est préférable de disséquer au moins une partie de l'un des nerfs qui proviennent de la STG, même si ces nerfs ne sont pas nécessaires pour l'enregistrement. Ils peuvent fournir des points d'ancrage supplémentaires stabiliser davantage le STG sur le plat. Il est préférable de les garder assez court pour un soutien maximum.
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Acknowledgments
Nous remercions sincèrement les membres du Laboratoire Marder. Nous remercions notre conseiller, la Dre Eve Marder, pour son soutien et ses encouragements. Cette recherche a été financée par l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies Subventions NS-17813 et NS-058 110.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Sylgard 170 | Other | Dow Corning | 170 | Gross Dissection |
| Fine Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Insect Pins size 6 | Surgery | Fine Science Tools | 26000-65 | |
| Mayo Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14110-17 | |
| Micro-Spatula | Surgery | WARD’s Natural Science | 15 V 4313 | |
| Rongeurs | Surgery | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Tissue Forceps | Surgery | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Surgery | California Fine Wire Company | Fine Dissection | |
| Forceps #5 | Surgery | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Surgery | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Surgery | Fine Science Tools | 15370-52 | |
| Petri Dish (100x15mm) | Other | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Pin Holder | Surgery | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Super fine forceps #5SF | Surgery | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Tungsten Needles | Surgery | Fine Science Tools | 10130-05 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Wild | MC3 | Misc. |
| Jonah Crab (C. borealis) | Animal | Commercial Lobster |
References
- Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , MIT Press. Boston. (1992).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).
- Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network. Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).
