Summary
Die stomatogastrischen Nervensystems (Tln) des Jonah Krabbe (
Abstract
Die stomatogastrischen Ganglion (STG) ist ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung zellulärer und Netzwerk-Interaktionen, da es eine relativ kleine Anzahl von Zellen (ca. 25 in C. borealis), die gut charakterisiert sind enthalten. Die Zellen in der STG zeigen eine breite Palette an Ausgängen und sind verantwortlich für die motorische Handlungen des Magens. Der Magen enthält die Magenmühle die bricht Essen mit drei internen Zähnen und dem Pylorus, die das Lebensmittel-Filter, bevor sie den Mitteldarm erreicht. Die STG stellt zwei rhythmische Ausgänge zu den Magenmühle und Pylorus als central pattern generators (CPG) bekannt zu kontrollieren. Jede Zelle in der STG kann in einem oder beiden dieser Rhythmen zu beteiligen. Diese Leitlinien erlauben für das Studium der Neuromodulation, Homöostase, Mobilfunk-und Netzwerk-Variabilität, Netzwerk-Entwicklung sowie Netzwerk Erholung.
Die Zerlegung der stomatogastrischen Nervensystems (Tln) aus dem Jonah Krabbe (Cancer borealis) ist in zwei Teile gemacht, die grobe und feine Dissektion. In der Brutto-Dissektion der gesamten Magen ist von der Krabbe seziert. Während der feinen Sezierung der Tln wird aus dem Magen mit einem Dissektionsmikroskop und Mikro-Dissektion-Tools (siehe Abbildung 1) extrahiert. Die Tln umfasst die STG, die ösophageale Ganglion (OG) und die kommissuralen Ganglien (CoG) sowie die Nerven, die die Bauchmuskulatur innervieren. Hier zeigen wir, wie eine komplette Zerlegung der Tln in Vorbereitung für eine elektrophysiologische Experiment, bei dem die Zellen in der STG von intrazellulär und der peripheren Nerven erfasst werden durchführen würde für extrazelluläre Ableitungen verwendet werden. Die richtige Technik für das Finden der gewünschten Nerven sowie unsere Technik der desheathing das Ganglion der Somata und Neuropil offenbaren gezeigt.
Protocol
1. Gross Dissection
- Legen Sie eine Krabbe auf Eis für 30 Minuten zu langweilig die sensorischen und motorischen Systemen des Tieres. Surround es von allen Seiten mit Eis. Die Handschuhe sollten bei der Handhabung des Krabben werden.
- Bereiten Sie sich auf die Brutto-Dissektion durch Auslegen der Dissektion Pfanne und Werkzeuge, die Sie verwenden möchten. Rongeure sind Knochen schneiden Schere, eine kleine Schere, gezahnte Pinzetten, Spatel mit einem sich verjüngenden Rand, eine schwarze Sylgard-beschichtete Schale, und Insekten Pins benötigt werden.
- Entfernen Sie die Katze aus dem Eiskübel durch seine Hinterbeine, um es von nicht gequetscht wird und es in der Sektion Pfanne.
- Entfernen Sie die Krallen erst durch Verdrehen jeweils nach innen. Dann entfernen Sie jedes Bein mit der gleichen Drehbewegung.
- Mit dem Rongeure, entfernen Sie den Oberkiefer für den Mund. Entfernen Sie auch die weichen maxillule.
- Mit dem Rongeure wieder von den seitlichen hinteren Ende des Panzers zu starten und einen guten Halt auf der Kante ist. Einen Riegel vorschieben mit dem Rongeure und brechen das Stück des Panzers aus. Achten Sie darauf, genug des Panzers zu entfernen, damit der Spachtel auf die Öffnung geben. Entfernen Sie weiterhin den Rand des Panzers bis zu den Augen und wiederholen Sie auf der anderen Seite.
- Mit der verjüngten Seite des Spatels vorsichtig kratzen die weiche innere Gewebe vom Dach des dorsalen Panzer. Halten Sie den Spachtel in Kontakt mit dem Panzer um eine Beschädigung der Tln. Verwenden Sie die Rongeure zu brechen die Teile des Panzers, die aus dem Gewebe getrennt wurden. Auch separaten einige der Weichgewebe von der ventralen Carapax achten Sie darauf, keine Adduktoren Befestigung des Gewebes auf den Panzer zu trennen.
- Brechen Sie die dorsale Carapax so weit posterior als das Herz, wenn es zwei kleine Knöchelchen ragt aus dem Panzer. Cut soweit vorderen wie möglich. Stabilisieren Sie die Cephalon (das "Gesicht") mit einem Finger, während Loslösung der vorderen Teile der dorsalen Panzer.
- Auf der Bauchseite des Panzers, ziehen Sie den Unterkiefer ein zu einer Zeit durch die Verankerung der Rongeure auf einen Unterkiefer, das Drehen von ihnen nach außen, um den Unterkiefer aus den beigefügten Epistom zu vertreiben, und zieht ihn weg. Zwei lange Gehörknöchelchen mit Muskeln sollten die extrahierten Unterkiefer angebracht sein, wenn man es richtig macht.
- Separate weg das Gewebe an den Seiten des Cephalon in der Nähe der Augen mit dem Spatel. Mit kleinen Dissektion Schere, über das Gewebe möglichst nahe am Grat des Gehörknöchelchen geschnitten wie möglich Schicht für Schicht.
- Rest der Krabben gegen eine Wand der Dissektion Pfanne und stützt es die Sicherung es im Ort (die Krallen können für diese verwendet werden). Schneiden Sie das Labrum ("upper lip") vom Epistom darf dabei nicht verlassen jedes Gewebe angebracht. Mit Knochen-Scherenschnitt machen zwei diagonale Schnitte in die ventralen Carapax, die Cephalon entfernen.
- Nehmen Sie das Labrum mit gezahnten Pinzette und schneiden das Labium ("Unterlippe") weg von der Gehörknöchelchen auf der Bauchseite. Dann heben die Lippe vom übrigen ventralen Carapax. Verwenden Sie die kleine Schere zum ventralen Teil des Magens aus dem Gewebe Innenfutter des Panzers zu trennen. Wenn der Pylorus Ampullen sichtbar sind, schneiden Sie den Bauch weg aus dem Gewebe auf beiden Seiten, bis der Magen von der Krabbe gewonnen wird.
- Dennoch hält der Magen durch die Lippe mit einer Pinzette, Rest des Magens gegen die Handfläche und gießen in den Mund Kochsalzlösung. Dies erweitert den Magen und macht es einfacher, aufgeschnitten. Cut aus der Öffnung an der Mündung nach unten zwischen den Pylorus quer durch die Gehörknöchelchen zwischen den Ampullen. Dann schräg nach unten schneiden durch die beiden kardialen Äste. Schneiden Sie die Spitzen der drei Zähne im Inneren des Magens.
- Setzen Sie den Magen auf eine große, schwarz, Sylgard-beschichtete Platte mit der Innenseite des Magens nach unten. Pin auf der fünf Ecken der Zubereitung mit dem Insekten-Pins und füllen Sie die Schale mit kalter Kochsalzlösung, das Eintauchen des gesamten Vorbereitung (siehe Abbildung 1).
2. Feine Dissection
- , Micro-Dissektion Werkzeuge sind für die feinen Sezierung benötigt. Insbesondere sind Pinzette und Schere Frühjahr sowie eine Pin-Halter mit einer Wolfram-Nadel benötigt wird. Eine klare, Sylgard-beschichtet, Petrischale und einige feine Drahtstifte sollten auch bereit gewesen.
- Beginnend auf der untersten Vergrößerung durch Pinning Sie die Klappen in der Nähe der Lippe, die die Mundöffnung verwendet werden beginnen. Ordnen Sie den Rest des Pins, um die Vorbereitung straff und Pin anderen Bereichen notwendig.
- Heben Sie den gefleckten Unterhaut für den unteren Teil der Vorbereitung und schneiden Sie es in ganz verlassen ein Stück Unterhaut mit zwei weißen Punkten.
- Peel die gelbe, wispy, häutigen Gewebe in der Nähe der Unterseite der Vorbereitung. Die mvns schwach an der Unterseite dieses Gewebes angebracht. Sorgfältig trennen die mvns aus dem gelben Gewebe, wie es ist nach oben gezogen. Folgen Sie den gelben Gewebe zerschnitten und zusammen mit dem Gehirn.
- Folgen Sie den dicken Prozesse Verlassen des Gehirns, erweitern laterally. Dies sind die commisural Nerven. Nach dem Ende des kommissuralen Nerven erreicht ist, entfernen Sie die Masse schwammig, off-white Gewebe weggeschnitten ist von der Seite des Gehirns.
- Wo die Ionen und die Söhne der Koggen treffen, schneiden Sie die Muskeln und Gewebe, um die Länge der Ionen und Söhne zu offenbaren.
- Return to the spotted Unterhaut Patch und hau sie ab. Dies sollte zu verlassen eine Öffnung in der Arterie um die STG. Cut durch die Öffnung zu den beiden Muskeln, die Flanke des STG zu trennen. Heben Sie die Enden dieser Muskeln und schneiden direkt unter ihnen ihnen von der Arterie zu trennen und die alns und AGNs aussetzen. Trennen Sie die flankierenden Muskeln so weit als der Knorpel, der über dem stn.
- Schneiden Sie das arterielle Gewebe rund um das STG nach unten, wo die mvns, DGN, und dvn gerecht zu werden. Die Arbeit auf der dvn die lvns und Durchtrennung der weißlichen, zarten Gewebe für den lvns.
- Suchen Sie den psn über die Gehörknöchelchen in der Nähe der Unterseite der Vorbereitung. Die psn kann die lvn und dlvn Kreuzung zu lokalisieren.
- Als nächstes folgen die dlvn bis zum PYN und pdn finden. Die PYN oft Packungen über den Pylorus Ampulle zur Eröffnung. Die pdn zweigt der dlvn und ist zwischen den Pylorus Ampulle und das Herz Pylorus Ventil Muskeln. Lassen Sie einige Muskeln an einer dieser Nerven, weil sie leicht verwechselt werden können, wenn die Vorbereitung auf die klare Sylgard Gericht übertragen wird.
- Wenn alle die Nerven freigelegt, sever verbleibenden Verbindungen zwischen den Tln und das Gewebe und unerwünschte Nerven des Magens. Bringen Sie den Tln vom Rest des Magens, Schneiden jede verpasste Anschlüsse.
- Zustand der klaren Sylgard Gericht mit der übrigen Masse des Magengewebes durch Reiben über die Oberfläche des Sylgard bis Sylgard fühlt sich nicht mehr zu klebrig oder trocken. Sylgard ist hydrophob und die Tln wird stark haften, wenn die Sylgard-beschichtete Spiegel ist nicht in dieser Weise konditioniert.
- Fügen Sie einige kalte Kochsalzlösung in die Schale. Besorgen Sie sich die oberen Enden der kommissuralen Nerven mit einer Pinzette und bringen die Tln die klare Sylgard Gericht.
- Pin der Tln nach unten auf die Sylgard. Sever das Gehirn aus dem kommissuralen Nerven und die minuten Stifte zu den vier Enden der Zähne sich zuerst zu sichern. Stellen Sie sicher, dass die Vorbereitung der rechten Seite wird durch die Überprüfung, dass die ivn nach oben zeigt weg von der Sylgard. Die DGN sollte leicht Ausfahrt unter der STG, wenn die STG ist rechts oben. Pin den Rest der Nervenenden sich mit dem feinen Draht Stifte.
- Entfernen Sie vorsichtig jede verbleibende Muskeln oder Gewebe aus dem Tln.
- Desheath die STG mit einem Stifthalter und ein leicht süchtig, fein, Wolframnadel. Machen Sie ein kleines Loch in einer Ecke des STG Scheide vom Zellkörper und die Nutzung dieses Loch zwischen den Schichten des Mantels zu bekommen. Schneiden Sie vorsichtig eine Klappe getrennt Mantel der STG Neuropil und Zellkörper aussetzen.
- Pin keine Klappen der Scheide nach unten, um die Zugänglichkeit zu den Zellkörper zu erhöhen und die STG für intrazelluläre Ableitungen zu stabilisieren. Re-pin den Rest der Tln sicherzustellen, dass jeder Nerv angespannt ist und gut für die extrazelluläre Aufnahme (siehe Abbildung 3) angeordnet.
3. Ergebnisse
- Im Idealfall sollten alle von den Nerven frei von Kerben und Schäden, insbesondere diejenigen, die aus aufgenommen wird. Keiner der Nerven sollten verheddert oder verdreht werden. Die STG sollte intakt sein mit all der Zellen in einen Bart Formation um das Neuropil angeordnet. Die intakte Tln ist bilateral symmetrisch und sieht aus wie ein Homunculus mit der lvns als die Beine, die mvns wie die Arme und das vordere Ende wie der Kopf.
Abkürzungen:
| Tln | Stomatogastrischen Nervensystems |
| STG | Stomatogastrischen Ganglion |
| CoG | Kommissuralen Ganglion |
| OG | Ösophagus Ganglion |
| mvn | Median ventrikuläre Nerven |
| Ion | Inferior ösophagealen Nerven |
| Sohn | Überlegene ösophagealen Nerven |
| agn | Magenvorderwand Nerven |
| aln | Vorderen seitlichen Nerven |
| dgn | Dorsal Magen Nerven |
| dvn | Dorsal ventrikuläre Nerven |
| lvn | Lateral ventrikuläre Nerven |
| psn | Posterior Magen Nerven |
| PYN | Pylorusstenose Nerven |
| pdn | Pylorusstenose Dilatator Nerven |
| dlvn | Dorsalen Ast der lateralen Ventrikel Nerven |
| ivn | Inferior ventrikuläre Nerven |
Abbildung 1: Schematische Darstellung der ungefähren Position des Tln in den Magen vor Dissektion.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der verschiedenen Muskeln im unteren Teil des Magens und eine Überlagerung der Tln in hellgrün. Jeder Zelltyp in der STG ist mit den Muskeln sie bekannt zu innervieren aufgeführt sind. Diese Karte ist hilfreich bei der Planung zu einem Nerv, der ein Signal von einer Zelle (mit freundlicher Genehmigung des Nadim lab) führt zu sezieren.
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Tln mit intrazellulären Elektroden und extrazellulären Brunnen (von Marder und Bucher, 2007).
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Discussion
Die Tln Dissektion ist der erste Schritt in der Durchführung einer elektrophysiologischen oder Immunhistochemie Experiment, oder zur Gewinnung von Zellen für die Zellkultur. Unabhängig von der beabsichtigten Experiment werden die Brutto-Dissektion bleiben unverändert. Allerdings können die feinen Sezierung variieren. Es ist wichtig, vor der Zeit, die Zellen und die Nerven Sie von Datensatz planen. Die meisten Neuronen in der STG haben Prozesse, die mindestens einen Muskel innervieren in den Magen (siehe Abbildung 2) und sind entsprechend ihrer innervierten Ziel eingestuft. Daher sind extrazelluläre Ableitungen, die zur vollständigen Überprüfung der Identität einer Zelle, die gerade aufgenommen wird intrazellulär. Der Pylorus Rhythmus der Frequenz und Robustheit werden verwendet, um die Gesundheit der Vorbereitung zu überwachen. Daher sind viele Experimente extrazellulären Aufnahmen aus dem LVN. Die DGN ist häufig verwendet, um die Magen-Rhythmus zu überwachen. Die STN ist oft entscheidend für die meisten Experimente, weil es viele modulatorische Zellen sind in der vorderen Ende des Tln und Severing, die Nerven kann dazu führen, den Pylorus und Magen-Rhythmen zu hören oder zu unregelmäßig.
Auch wenn die Reihenfolge, in der die Schritte in der feinen Sezierung fertig sind ist nicht wichtig finden wir es leichter, die Tln ohne Schaden, indem sie die Enden der peripheren Nerven auf den Muskel verankert zu entfernen, bis nach der STG hat aus den umliegenden getrennt Gewebe. Dies hält die STG und stn straff genug, um leicht und sicher entfernen die Muskeln und Gewebe um sie herum.
Nachdem das Präparat in den klaren Sylgard Gericht, sollte jedes Gewebe, die auf der Tln bleibt entfernt, um ihre Einmischung in die Elektroden während eines Experiments zu vermeiden. Es ist auch einfacher, gute, stabile Aufnahmen zu bekommen, wenn die Zubereitung nach unten so straff wie möglich, ohne dass Schäden an den Nerven merken. Es ist besonders wichtig, dass die STG sich sicher durch den alns mit kurzen Stiften auf die intrazellulären Elektroden Zugang zu bieten, wie viele Zellen wie möglich merken. Es ist besser, sezieren Sie zumindest einen Teil eines der Nerven, die vom STG auch wenn diese Nerven nicht für die Aufnahme benötigt stammen. Sie liefern zusätzliche Anker eine weitere Stabilisierung der STG auf den Teller. Es ist am besten, um sie ziemlich kurz für maximale Unterstützung.
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Acknowledgments
Wir danken den Mitgliedern der Marder Lab. Wir danken unseren Berater, Dr. Eva Marder, für ihre Unterstützung und Ermutigung. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grants NS-17813 und NS-058110 gefördert.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Sylgard 170 | Other | Dow Corning | 170 | Gross Dissection |
| Fine Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Insect Pins size 6 | Surgery | Fine Science Tools | 26000-65 | |
| Mayo Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14110-17 | |
| Micro-Spatula | Surgery | WARD’s Natural Science | 15 V 4313 | |
| Rongeurs | Surgery | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Tissue Forceps | Surgery | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Surgery | California Fine Wire Company | Fine Dissection | |
| Forceps #5 | Surgery | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Surgery | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Surgery | Fine Science Tools | 15370-52 | |
| Petri Dish (100x15mm) | Other | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Pin Holder | Surgery | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Super fine forceps #5SF | Surgery | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Tungsten Needles | Surgery | Fine Science Tools | 10130-05 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Wild | MC3 | Misc. |
| Jonah Crab (C. borealis) | Animal | Commercial Lobster |
References
- Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , MIT Press. Boston. (1992).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).
- Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network. Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).
