Summary
O sistema nervoso stomatogastric (STNS) do caranguejo Jonas (
Abstract
O gânglio stomatogastric (STG) é um excelente modelo para estudar interações celulares e de rede, porque contém um número relativamente pequeno de células (aproximadamente 25 em C. borealis), que estão bem caracterizadas. As células do STG exibem uma ampla gama de produtos e são responsáveis pelas ações motoras do estômago. O estômago contém o moinho gástrico que quebra os alimentos, com três dentes internos, e do piloro que filtra o alimento antes de chegar ao intestino médio. O STG produz duas saídas rítmica para controlar o moinho gástrico e do piloro conhecidos como geradores de padrão central (CPG). Cada célula do STG pode participar em um ou ambos os ritmos. Estes CPG permitir o estudo de neuromodulação, a homeostase, a variabilidade celular e rede, desenvolvimento da rede, e recuperação da rede.
A dissecção do sistema nervoso stomatogastric (STNS) do caranguejo Jonas (Cancer borealis) é feito em duas partes: a dissecção macroscópica e multa. Na dissecção bruto todo o estômago é dissecada do caranguejo. Durante a dissecção fina do STNS é extraído do estômago usando um microscópio de dissecção e micro-dissecção ferramentas (ver figura 1). O STNS inclui o STG, o gânglio esofágica (OG), e os gânglios comissural (CoG), bem como os nervos que inervam os músculos do estômago. Aqui, vamos mostrar como realizar uma dissecação completa do STNS em preparação para um experimento de eletrofisiologia, onde as células do STG seria gravado a partir intracelularmente e os nervos periféricos seria usado para gravações extracelular. A técnica adequada para encontrar os nervos desejado é mostrado, assim como nossa técnica de desheathing o gânglio para revelar o somata e neuropil.
Protocol
1. Dissecação bruta
- Coloque um caranguejo no gelo por 30 minutos para maçante os sistemas sensoriais e motoras do animal. Rodeiam por todos os lados com gelo. Devem ser usadas luvas ao manusear o caranguejo.
- Prepare-se para a dissecção macroscópica fazendo o layout da pan dissecção e as ferramentas que você irá usar. Rongeurs, osso de corte de tesoura, tesoura pequena, pinça dentada, uma espátula com uma borda afilada, um prato Sylgard revestido preto, e pinos de insetos são necessários.
- Remova o caranguejo do balde de gelo por sua perna para evitar que ele beliscar e colocá-lo na panela de dissecação.
- Remova as garras primeiro torcendo cada uma para dentro. Em seguida, retire cada perna usando o mesmo movimento de torção.
- Usando o fórceps, remova a maxila cobrindo a boca. Também remover o maxillule macio.
- Usando o fórceps de novo, começar a partir da extremidade lateral posterior da carapaça e obter uma boa aderência na borda do mesmo. Reprimir com o fórceps e quebrar aquele pedaço de carapaça off. Certifique-se de remover o suficiente da carapaça para permitir a espátula para entrar na abertura. Continue removendo a borda da carapaça até os olhos e repita do outro lado.
- Com o lado cônico da espátula, raspe o tecido mole interior longe do telhado da carapaça dorsal. Mantenha a espátula em contato com a carapaça para evitar danificar o STNS. Usar o fórceps de romper com as peças da carapaça que foram separados do tecido. Também separar alguns dos tecidos moles da carapaça ventral certificando-se de separar todos os músculos adutores prender o tecido para a carapaça.
- Romper a carapaça dorsal, tanto posterior como o coração, onde existem dois pequenos ossículos saindo da carapaça. Corte, tanto anterior quanto possível. Estabilizar a Cephalon (a "cara") com um dedo enquanto rompendo as partes mais anterior da carapaça dorsal.
- No lado ventral da carapaça, puxe a uma mandíbula de uma vez por ancorar a fórceps em uma mandíbula, distorcendo-os para fora, para desalojar a mandíbula do epistome em anexo, e puxando-o para longe. Dois ossículos tempo com os músculos devem ser anexados à mandíbula extraída se feito corretamente.
- Separe afastado o tecido dos lados da Cephalon perto dos olhos usando a espátula. Dissecção com tesoura pequena, corte todo o tecido tão perto do cume de ossicular como camada por camada possível.
- Resto do caranguejo contra a parede da panela dissecção e sustentá-lo acima prendendo-o no lugar (as garras podem ser usados para isso). Corte o labrum ("lábio superior") de distância da epistome tomando cuidado para não deixar qualquer tecido em anexo. Usando osso de corte de tesoura fazer dois cortes diagonais na carapaça ventral para remover o Cephalon.
- Leve o labrum com uma pinça dentada e cortou o lábio ("lábio inferior") de distância da ossicular no lado ventral. Em seguida, levante suavemente o lábio longe do restante da carapaça ventral. Use a tesoura pequena para separar a parte ventral do estômago a partir do tecido que reveste a carapaça. Quando o piloro ampolas são visíveis, corte o estômago longe do tecido de cada lado até que o estômago é extraído do caranguejo.
- Ainda segurando o estômago pelo lábio com uma pinça, o resto do estômago contra a palma da mão e coloque soro fisiológico na boca. Isso expande o estômago e facilita o corte aberto. Corte a partir da abertura da boca para baixo entre o direito através do piloro ossicular entre os ampolas. Em seguida, corte na diagonal para baixo através dos dois ramos do miocárdio. Cortar as pontas dos três dentes dentro do estômago.
- Coloque o estômago em um grande, preto, prato Sylgard revestido com o interior do estômago para baixo. Pino para baixo dos cinco cantos da preparação com os pinos de insetos e encher a placa com solução salina fria, mergulhando toda a preparação (ver figura 1).
2. Dissecação fina
- , Dissecção Micro-ferramentas são necessárias para a dissecção fina. Em particular, pinças e tesouras primavera são necessários, bem como um suporte de pino com uma agulha de tungstênio. A clara, Sylgard revestido prato, petri e alguns pinos de fio fino também deveria ter sido preparado.
- Início com a menor ampliação, começar por fixar para baixo as abas perto do lábio que costumava ser a abertura da boca. Reorganizar o resto dos pinos para fazer a preparação tenso e pin quaisquer outras áreas necessárias.
- Levante cuidadosamente a hipoderme viu que cobrem a parte inferior da preparação e corte-lo em toda deixando um pedaço de hipoderme com dois pontos brancos.
- Descasque a amarelo, tecido, wispy membranosa perto da parte inferior da preparação. O mvns são fracamente acoplada à parte inferior deste tecido. Separe cuidadosamente a mvns a partir do tecido amarelo como é puxado para cima. Siga o tecido amarelo e corte ao lado do cérebro.
- Acompanhar os processos de espessura sair do cérebro que se estendem laterally. Estes são os nervos commisural. Uma vez que o fim do nervo comissural é atingido, retire a massa esponjosa, tecido off-white que foi cortado do lado do cérebro.
- Onde os íons e os filhos de satisfazer as CGs, corte o tecido muscular e para revelar o tamanho dos íons e filhos.
- Retornar para o patch hipoderme manchado e cortá-lo. Isso deve deixar uma abertura na artéria em torno do STG. Cortar a abertura para separar os dois músculos que ladeiam o STG. Levante as extremidades destes músculos e corte logo abaixo deles para separá-los da artéria e expor o alns e AGNs. Separar os músculos de acompanhamento, tanto para cima como a cartilagem deitado sobre o stn.
- Cortar o tecido arterial em torno do STG até onde o mvns, dgn, DVN e se encontram. Trabalhar as DVN ao LVNs e cortar o tecido, esbranquiçada delicada que cobre o LVNs.
- Localize a psn sobre o ossicular perto da parte inferior da preparação. O psn pode ser usado para localizar o lvn ea junção dlvn.
- Em seguida siga as dlvn para baixo para localizar o pyn e pdn. O pyn muitas vezes envolve mais a ampola pilórica à abertura. O pdn garfos fora do dlvn e está entre os ampola pilórica eo cardio músculos válvula pilórica. Deixe algum músculo ligado a um desses nervos, porque eles podem ser facilmente confundidos quando a preparação é transferido para o prato Sylgard claro.
- Depois de todos os nervos foram descobertos, cortar todas as conexões entre os restantes STNS e os nervos do tecido e indesejados do estômago. Mover cuidadosamente o STNS longe do resto do estômago, cortando as ligações não atendidas.
- Condição o prato Sylgard clara com a massa restante do tecido do estômago, esfregando-o sobre a superfície do Sylgard até o Sylgard já não se sente muito pegajosa ou seca. Sylgard é hidrofóbico e STNS irá aderir fortemente a ele se o prato Sylgard revestido não está condicionada desta forma.
- Adicione um pouco de soro fisiológico frio para o prato. Agarre as extremidades superiores dos nervos comissural com uma pinça e trazer o STNS ao prato Sylgard claro.
- Pin do STNS para baixo na Sylgard. Sever do cérebro dos nervos comissural e usar os pinos Minuten para garantir as quatro extremidades das engrenagens para baixo primeiro. Garantir que a preparação é do lado certo, verificando que o ivn está apontando para cima longe do Sylgard. O dgn deve sair ligeiramente abaixo da STG quando o STG é do lado direito para cima. Pin o resto do nervo termina-se com os pinos de arame fino.
- Limpe qualquer músculo ou tecido restante do STNS.
- Desheath o STG usando um suporte de pino e um pouco viciado, agulha de tungstênio fino,. Faça um pequeno furo em um canto da bainha STG longe do corpo celular e use o buraco para chegar entre as camadas de revestimento. Corte cuidadosamente uma ponta da bainha separados para expor o neuropil STG e corpos celulares.
- Pin qualquer flaps da bainha para baixo para aumentar a acessibilidade para os corpos celulares e estabilizar o STG para gravações intracelular. Re-pin o resto do STNS garantir que cada nervo é tenso e bem espaçados para a gravação extracelular (ver figura 3).
3. Resultados
- Idealmente, todos os nervos devem estar livres de nicks e danos, particularmente os que vão ser gravados a partir. Nenhum dos nervos devem ser enrolados ou trançados. O STG deve estar intacto, com todas as células dispostas em uma formação barba ao redor do neurópilo. O STNS intacta é bilateral simétrica e se parece com um homúnculo com o LVNs como as pernas, o mvns como os braços e as extremidade anterior como chefe.
Abreviaturas:
| STNS | Sistema nervoso Stomatogastric |
| STG | Gânglio Stomatogastric |
| CoG | Gânglio comissural |
| OG | Gânglio esofágico |
| mvn | Nervo mediano ventricular |
| íon | Esofágico inferior do nervo |
| filho | Nervo esofágico Superior |
| AGN | Nervo gástrica anterior |
| ALN | Nervo lateral anterior |
| dgn | Nervo dorsal gástrica |
| DVN | Nervo dorsal ventricular |
| lvn | Nervo ventricular laterais |
| psn | Nervo posterior do estômago |
| pyn | Nervo pilórica |
| pdn | Nervo dilatador pilórica |
| dlvn | Ramo dorsal do nervo ventricular laterais |
| ivn | Nervo ventricular inferior |
Figura 1: Diagrama ilustrando o posicionamento aproximado da STNS no estômago antes da dissecção.
Figura 2: Diagrama de vários músculos na parte inferior do estômago e uma sobreposição da STNS em verde claro. Cada tipo de célula no STG está listado com os músculos são conhecidos para inervar. Este mapa é útil quando o planejamento para dissecar um nervo que transporta um sinal de uma determinada célula (cortesia do laboratório Nadim).
Figura 3: Diagrama esquemático do STNS com eletrodos intracelulares e extracelulares poços (de Marder e Bucher, 2007).
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Discussion
A dissecção STNS é o primeiro passo na realização de um experimento de eletrofisiologia ou imuno-histoquímica, ou para a obtenção de células para cultura de células. Independentemente da experiência pretendida, a dissecção macroscópica permanecerá inalterada. No entanto, a dissecção multa pode variar. É importante planejar com antecedência quais as células e que os nervos você vai gravar a partir de. A maioria dos neurônios no STG têm processos que inervam pelo menos um músculo do estômago (ver figura 2) e são classificados de acordo com seu alvo inervados. Portanto, as gravações extracelular são obrigados a totalmente verificar a identidade de uma célula que está sendo gravada no meio intracelular. Freqüência o ritmo pilórica e robustez são usados para monitorar a saúde da preparação. Portanto, muitos experimentos incluem gravações extracelular do lvn. O dgn é comumente usado para monitorar o ritmo gástrico. A STN é muitas vezes crucial para a maioria dos experimentos, porque há muitas células modulatório na extremidade anterior do STNS e rompendo esse nervo pode causar a ritmos pilórica e gástrico para cessar ou tornar-se irregular.
Mesmo que a ordem em que as etapas da dissecção fina é feito não é importante, achamos mais fácil de remover o STNS sem danos, mantendo as extremidades dos nervos periféricos ancorado ao músculo até que o STG foi desligado da envolvente tecido. Isso mantém o suficiente STG e stn esticada de forma segura e facilmente remover os músculos e tecidos ao seu redor.
Uma vez que a preparação está no prato Sylgard claro, qualquer tecido que permanece na STNS deve ser removida para evitar sua interferência com os eletrodos durante um experimento. É também mais fácil de obter bom, registros estáveis quando a preparação é preso como tensa possível, sem causar danos aos nervos. É particularmente importante que o STG ser preso de forma segura pelo alns com pinos curto para permitir o acesso eletrodos intracelulares como células possível. É preferível para dissecar, pelo menos, parte de qualquer dos nervos que se originam a partir do STG mesmo que os nervos não são necessários para a gravação. Eles podem fornecer âncoras extras adicionais de estabilização do GTS no prato. É melhor mantê-los bastante curtos para o máximo apoio.
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Acknowledgments
Agradecemos aos membros do Laboratório de Marder. Agradecemos aos nossos conselheiro, Dr. Eve Marder, por seu apoio e encorajamento. Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame Grants NS-NS-17813 e 058110.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Sylgard 170 | Other | Dow Corning | 170 | Gross Dissection |
| Fine Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Insect Pins size 6 | Surgery | Fine Science Tools | 26000-65 | |
| Mayo Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14110-17 | |
| Micro-Spatula | Surgery | WARD’s Natural Science | 15 V 4313 | |
| Rongeurs | Surgery | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Tissue Forceps | Surgery | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Surgery | California Fine Wire Company | Fine Dissection | |
| Forceps #5 | Surgery | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Surgery | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Surgery | Fine Science Tools | 15370-52 | |
| Petri Dish (100x15mm) | Other | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Pin Holder | Surgery | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Super fine forceps #5SF | Surgery | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Tungsten Needles | Surgery | Fine Science Tools | 10130-05 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Wild | MC3 | Misc. |
| Jonah Crab (C. borealis) | Animal | Commercial Lobster |
References
- Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , MIT Press. Boston. (1992).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).
- Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network. Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).
