Summary
योना केकड़ा के stomatogastric तंत्रिका प्रणाली (STNS) (
Abstract
stomatogastric नाड़ीग्रन्थि (STG) और सेलुलर नेटवर्क बातचीत के अध्ययन के लिए एक शानदार मॉडल है क्योंकि यह कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या (लगभग 25 सी. बोरेलिस में), जो अच्छी तरह से विशेषता है शामिल है. STG में कोशिकाओं outputs के एक व्यापक रेंज प्रदर्शन और पेट की मोटर कार्यों के लिए जिम्मेदार हैं. पेट गैस्ट्रिक मिल जो नीचे तीन आंतरिक दांत के साथ खाना है, और जठरनिर्गम जो भोजन फिल्टर से पहले यह midgut तक पहुँचता टूट जाता है शामिल हैं. STG दो लयबद्ध गैस्ट्रिक मिल और केंद्रीय पैटर्न जनरेटर (CPGs) के रूप में जाना जाता जठरनिर्गम नियंत्रण outputs के उत्पादन करता है. STG में प्रत्येक कोशिका एक या इन लय के दोनों में भाग ले सकते हैं. ये CPGs neuromodulation, homeostasis के अध्ययन, सेलुलर नेटवर्क और परिवर्तनशीलता, नेटवर्क के विकास, और नेटवर्क वसूली के लिए अनुमति देते हैं.
योना केकड़ा (कैंसर बोरेलिस) से stomatogastric तंत्रिका तंत्र (STNS) के विच्छेदन के दो भागों में किया जाता है, सकल और ठीक विच्छेदन. सकल विच्छेदन में पूरे पेट केकड़ा से dissected है. ठीक विच्छेदन के दौरान STNS विच्छेदन खुर्दबीन और सूक्ष्म विच्छेदन उपकरण (1 आंकड़ा देखें) का उपयोग कर पेट से निकाला जाता है. STNS STG, oesophageal नाड़ीग्रन्थि (ओग), और commissural (दांता) ganglia के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नसों है कि पेट की मांसपेशियों अंदर आना भी शामिल है. यहाँ, हम बताते हैं कैसे जहां STG में कोशिकाओं intracellularly और परिधीय नसों से दर्ज होगा एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोग के लिए तैयार करने में STNS की एक पूरी विच्छेदन प्रदर्शन करने के लिए बाह्य रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. वांछित नसों को खोजने के लिए उचित तकनीक के रूप में अच्छी तरह से नाड़ीग्रन्थि desheathing somata और neuropil प्रकट की हमारी तकनीक के रूप में दिखाया गया है.
Protocol
1. सकल विच्छेदन
- जानवर की सुस्त संवेदी और मोटर प्रणाली के लिए 30 मिनट के लिए बर्फ पर एक केकड़ा रखें. यह बर्फ के साथ सभी पक्षों पर चारों ओर. दस्ताने जब केकड़े से निपटने पहना होना चाहिए.
- विच्छेदन पैन और उपकरण आप का उपयोग करेगा बिछाने द्वारा सकल विच्छेदन के लिए तैयार है. Rongeurs, हड्डी काटने कैंची, छोटे कैंची, दांतेदार संदंश, एक पतला बढ़त के साथ एक रंग, एक काला पकवान Sylgard लेपित, और कीट पिन की जरूरत है.
- उसके पिछले पैर से बर्फ बाल्टी से केकड़ा बन्द रखो से रोकने के लिए और यह विच्छेदन पैन में जगह निकालें.
- प्रत्येक आवक एक घुमा द्वारा पहली पंजे निकालें. फिर प्रत्येक एक ही घुमा गति का उपयोग करते हुए पैर हटा दें.
- Rongeurs का प्रयोग, मुंह को कवर maxilla हटा दें. इसके अलावा मुलायम maxillule हटा दें.
- Rongeurs का प्रयोग फिर कछुवे की पीठ की हड्डी का पार्श्व पीछे अंत से शुरू और यह के किनारे पर एक अच्छी पकड़ प्राप्त. Rongeurs के साथ नीचे दबाना और कछुवे की पीठ की हड्डी का टुकड़ा है कि बंद तोड़ने. कछुवे की पीठ की हड्डी के लिए पर्याप्त को हटाने के लिए रंग खोलने में प्रवेश करने की अनुमति सुनिश्चित करें. कछुवे की पीठ की हड्डी के किनारे हटाने आंखों को जारी रखें और दूसरी तरफ दोहराएँ.
- रंग का पतला पक्ष के साथ, धीरे नरम भीतरी ऊतक दूर परिमार्जन पृष्ठीय कछुवे की पीठ की हड्डी की छत से. कछुवे की पीठ की हड्डी STNS हानिकारक से बचने के के साथ संपर्क में रंग रखें. Rongeurs को दूर कछुवे की पीठ की हड्डी के भागों है कि ऊतक से अलग हो गया है को तोड़ने का प्रयोग करें. इसके अलावा किसी भी अभिवर्तक कछुवे की पीठ की हड्डी के लिए ऊतक संलग्न मांसपेशियों अलग सुनिश्चित करने के उदर कछुवे की पीठ की हड्डी से मुलायम ऊतकों की कुछ अलग है.
- दूर दूर दिल है जहाँ वहाँ दो छोटे कछुवे की पीठ की हड्डी से उभड़नेवाला ossicles के रूप में पीछे के रूप में पृष्ठीय कछुवे की पीठ की हड्डी तोड़ो. कट के रूप में पूर्वकाल तक के रूप में संभव है. एक उंगली से Cephalon ("सामना") स्थिर जबकि दूर पृष्ठीय कछुवे की पीठ की हड्डी का सबसे पूर्वकाल भागों में टूट.
- कछुवे की पीठ की हड्डी के ventral पक्ष पर, जबड़ा पर rongeurs प्रस्तोता द्वारा एक समय में एक mandibles, पुल उन्हें घुमा बाहर संलग्न epistome से जबड़ा हटाना, और इसे दूर खींच. मांसपेशियों के साथ दो लंबे ossicles निकाले जबड़ा संलग्न किया जाना चाहिए अगर ठीक से किया है.
- रंग का उपयोग कर आँखों के पास Cephalon की तरफ से दूर ऊतक अलग. छोटे विच्छेदन कैंची, हड्डी के रिज करने के लिए निकट के रूप में ऊतक भर परत संभव परत के रूप में कटौती के साथ.
- विच्छेदन पैन की एक दीवार के खिलाफ केकड़े आराम और यह सहारा यह जगह में हासिल (पंजे इस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है). ("ऊपरी होंठ") के लिए नहीं छोड़ किसी भी ऊतक संलग्न सुनिश्चित करने के epistome से दूर labrum कट. हड्डी काटने कैंची का प्रयोग वेंट्रल कछुवे की पीठ की हड्डी में दो विकर्ण में कटौती करने के लिए Cephalon हटायें.
- दांतेदार संदंश के साथ labrum ले लो और ("निचले होंठ") ventral पक्ष पर हड्डी से दूर कटौती labium. फिर धीरे होंठ दूर लिफ्ट शेष वेंट्रल कछुवे की पीठ की हड्डी से. कछुवे की पीठ की हड्डी अस्तर ऊतकों से पेट के उदर भाग को अलग छोटे कैंची का प्रयोग करें. जब जठरनिर्गम ampullae दिखाई दे रहे हैं, पेट के दोनों तरफ के ऊतकों से दूर कटौती जब तक पेट केकड़ा से निकाला जाता है.
- फिर भी होंठ द्वारा संदंश के साथ पेट, धारण हाथ की हथेली के खिलाफ पेट को आराम है और मुंह में खारा डाल. यह पेट का विस्तार है और यह आसान खुला कटौती करने के लिए बनाता है. Ampullae बीच हड्डी के माध्यम से जठरनिर्गम अधिकार के बीच नीचे मुँह खोलने से कट. फिर दो cardial शाखाओं के माध्यम से तिरछे कटौती. तीन दांत पेट के अंदर के सुझावों कट.
- नीचे पेट के अंदर के साथ एक बड़े, काले, Sylgard लेपित पकवान पर पेट रखें. कीट पिन के साथ तैयारी के पांच कोनों नीचे पिन और ठंडे नमक के साथ पकवान भरने, पूरी तैयारी डुबो (1 आंकड़ा देखें).
2. ठीक विच्छेदन
- , लघु विच्छेदन उपकरण ठीक विच्छेदन के लिए आवश्यक हैं. विशेष रूप से, संदंश और वसंत कैंची के रूप में अच्छी तरह से एक टंगस्टन सुई के साथ एक पिन धारक के रूप में की जरूरत है. एक स्पष्ट, Sylgard लेपित, पेट्री डिश और कुछ ठीक तार पिन भी तैयार की गई.
- कम बढ़ाई पर शुरू, नीचे होंठ है कि मुँह खोलने का इस्तेमाल किया जा निकट फ्लैप लगाए द्वारा शुरू करते हैं. पिन के बाकी पुनर्व्यवस्थित तैयारी तना हुआ बनाने के लिए और किसी भी अन्य आवश्यक क्षेत्रों पिन.
- ध्यान से देखा तैयारी के निचले हिस्से को कवर hypodermis उठा और यह दो सफेद डॉट्स के साथ hypodermis एक पैच छोड़ने भर ट्रिम.
- पील ऊपर पीले, wispy, तैयारी के नीचे के निकट झिल्लीदार ऊतक. mvns दुर्बलता इस ऊतक के नीचे से जुड़े होते हैं. ध्यान से पीले ऊतकों से mvns अलग रूप में यह ऊपर खींच लिया है . पीले ऊतक का पालन करें और मस्तिष्क के बगल में कटौती.
- मोटी मस्तिष्क निकल प्रक्रियाओं का पालन करें कि का विस्तार laterallवाई ये commisural नसों हैं. एक बार commissural तंत्रिका के अंत तक पहुँच जाता है, खंखरा बंद सफेद, ऊतक के बड़े पैमाने पर है कि मस्तिष्क की ओर से दूर कटौती की गई है हटा दें.
- कहाँ आयनों और बेटों cogs मिलते हैं, मांसपेशियों और ऊतकों को आयनों और बेटों की लंबाई प्रकट काटा.
- देखा hypodermis पैच करने के लिए वापसी और इसे काट. यह धमनी में एक खोलने STG आसपास छोड़ देना चाहिए. खोलने के माध्यम से कट करने के लिए दो कि पार्श्व STG मांसपेशियों को अलग. इन मांसपेशियों की छोर लिफ्ट और अधिकार में कटौती नीचे धमनी से उन्हें अलग करने के लिए और alns और agns बेनकाब. Flanking मांसपेशियों STN से अधिक झूठ बोल उपास्थि के रूप में के रूप में अब तक अलग है.
- दूर धमनी STG आसपास जहां mvns, dgn करने के लिए नीचे के ऊतकों कट , और dvn मिलने. नीचे lvns करने के लिए dvn कार्य और सफेद, नाजुक lvns कवर के ऊतकों के माध्यम से कटौती.
- तैयारी के नीचे के निकट हड्डी पर PSN पता लगाएँ. PSN LVN और dlvn जंक्शन पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- अगले dlvn का पालन करें नीचे pyn और PDN पता लगाने. pyn अक्सर जठरनिर्गम ampulla अधिक खोलने के लिए wraps. dlvn के PDN बंद कांटे और जठरनिर्गम ampulla और कार्डियो जठरनिर्गम वाल्व मांसपेशियों के बीच है . इन तंत्रिकाओं के लिए जुड़ा हुआ क्योंकि वे आसानी से हो सकता है जब तैयारी स्पष्ट Sylgard पकवान करने के लिए स्थानांतरित कर रहा है भ्रमित कर सकते हैं कुछ मांसपेशियों छोड़ो.
- एक बार नसों के सभी पर्दाफाश किया गया है, तोड़ STNS और पेट के ऊतकों और अवांछित नसों के बीच किसी भी शेष कनेक्शन. ध्यान STNS पेट के बाकी हिस्सों से दूर ले जाने के लिए, किसी भी चूक कनेक्शन काटने.
- हालत Sylgard की सतह पर रगड़ जब तक Sylgard अब कोई भी चिपचिपा या सूखी लगता है पेट के ऊतकों के शेष जन के साथ स्पष्ट Sylgard पकवान. Sylgard hydrophobic है और STNS दृढ़ता से यह करने के लिए पालन Sylgard लेपित अगर पकवान इस तरह से वातानुकूलित है नहीं.
- पकवान के लिए कुछ ठंडा खारा जोड़ें. संदंश के साथ commissural नसों के ऊपरी छोर पकड़ो और स्पष्ट Sylgard पकवान करने के लिए STNS लाने.
- STNS Sylgard पर नीचे पिन. Commissural नसों से मस्तिष्क तोड़ और minuten पिन का उपयोग करने के लिए cogs के चार समाप्त होता है पहली बार नीचे सुरक्षित. सुनिश्चित करें कि तैयारी दाईं ओर जाँच है कि ivn Sylgard से दूर ओर इशारा करते है. dgn थोड़ा STG के नीचे से बाहर निकलें जब STG सही साइड चाहिए. तंत्रिका के बाकी पिन ठीक तार पिन के साथ नीचे समाप्त होता है.
- दूर किसी भी शेष या STNS से मांसपेशियों के ऊतकों को साफ.
- एक पिन धारक और एक थोड़ा झुका, ठीक है, टंगस्टन सुई का उपयोग STG Desheath. सेल शरीर से दूर STG म्यान के एक कोने में एक छोटा सा छेद बनाओ और है कि छेद का उपयोग करने के लिए म्यान के परतों के बीच. ध्यान से अलग म्यान के एक प्रालंब कटौती STG neuropil और सेल शरीर को बेनकाब.
- म्यान के किसी भी फ्लैप नीचे पिन सेल शरीर के लिए पहुँच बढ़ाने के लिए और रिकॉर्डिंग के लिए intracellular STG स्थिर. सुनिश्चित करना है कि प्रत्येक तंत्रिका तना हुआ है और अच्छी तरह से कोशिकी रिकॉर्डिंग (3 आंकड़ा देखें) के लिए दूरी STNS के बाकी को पुनः पिन.
3. परिणाम
- आदर्श रूप में, नसों के सभी nicks और नुकसान, विशेष रूप से लोगों से दर्ज हो जाएगा मुक्त किया जाना चाहिए. नसों में से कोई भी या उलझ मुड़ जाना चाहिए. STG neuropil के चारों ओर एक दाढ़ी के गठन में व्यवस्था की कोशिकाओं के सभी के साथ बरकरार किया जाना चाहिए. बरकरार STNS द्विपक्षीय सममित है और पैर, हथियार और सिर के रूप में पूर्वकाल अंत के रूप में mvns के रूप में lvns के साथ एक बौना की तरह लग रहा है.
लघुरूप:
| STNS | Stomatogastric तंत्रिका तंत्र |
| STG | Stomatogastric नाड़ीग्रन्थि |
| दांता | Commissural नाड़ीग्रन्थि |
| ओग | Oesophageal नाड़ीग्रन्थि |
| mvn | मंझला निलय तंत्रिका |
| आयन | अवर oesophageal तंत्रिका |
| बेटा | सुपीरियर oesophageal तंत्रिका |
| AGN | पूर्वकाल गैस्ट्रिक तंत्रिका |
| ALN | पूर्वकाल पार्श्व तंत्रिका |
| dgn | पृष्ठीय गैस्ट्रिक तंत्रिका |
| dvn | पृष्ठीय निलय तंत्रिका |
| LVN | पार्श्व निलय तंत्रिका |
| PSN | पोस्टीरियर पेट तंत्रिका |
| pyn | जठरनिर्गम तंत्रिका |
| PDN | जठरनिर्गम फैलनेवाली पेशी तंत्रिका |
| dlvn | पृष्ठीय पार्श्व निलय तंत्रिका की शाखा |
| ivn | अवर निलय तंत्रिका |
चित्रा 1: पेट में STNS की अनुमानित स्थान विच्छेदन के लिए पहले illustrating आरेख.
चित्रा 2: और हल्के हरे रंग में STNS की एक उपरिशायी पेट के निचले हिस्से में विभिन्न मांसपेशियों के आरेख. STG में प्रत्येक कोशिका प्रकार वे अंदर आना जाना जाता है मांसपेशियों के साथ सूचीबद्ध है. इस नक्शे उपयोगी है जब एक तंत्रिका जो एक दिया सेल (Nadim प्रयोगशाला के सौजन्य से) से एक संकेत किया जाता है टुकड़े करना करने की योजना बना.
चित्रा 3: intracellular इलेक्ट्रोड और कोशिकी कुओं (Marder और Bucher, 2007 से) के साथ STNS के योजनाबद्ध आरेख .
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Discussion
STNS विच्छेदन एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या immunohistochemistry प्रयोग, सेल संस्कृति के लिए कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए या प्रदर्शन में पहला कदम है. इरादा प्रयोग के बावजूद, सकल विच्छेदन अपरिवर्तित रहेगा. हालांकि, ठीक विच्छेदन भिन्न हो सकते हैं. यह समय जो कोशिकाओं और तंत्रिकाओं जो आप से रिकॉर्ड करेगा की आगे की योजना महत्वपूर्ण है. STG में अधिकांश न्यूरॉन्स प्रक्रियाओं है कि पेट में कम से कम एक मांसपेशियों अंदर आना (आंकड़ा 2 देखें) और उनके innervated लक्षित करने के लिए अनुसार वर्गीकृत कर रहे हैं. इसलिए, बाह्य रिकॉर्डिंग करने के लिए पूरी तरह से एक सेल की पहचान है कि intracellularly दर्ज किया जा रहा है सत्यापित करने के लिए आवश्यक हैं. जठरनिर्गम लय आवृत्ति और मजबूती के लिए तैयारी के स्वास्थ्य की निगरानी के लिए उपयोग किया जाता है. इसलिए, कई प्रयोगों LVN से कोशिकी रिकॉर्डिंग शामिल हैं. dgn सामान्यतः करने के लिए गैस्ट्रिक लय पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया है. STN अक्सर सबसे प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि वहाँ STNS के पूर्वकाल अंत में कई modulatory कोशिकाओं रहे हैं कि तंत्रिका विच्छेद जठरनिर्गम और गैस्ट्रिक लय संघर्ष या अनियमित हो पैदा कर सकता है .
हालांकि जिस क्रम में ठीक विच्छेदन में कदम कर रहे हैं महत्वपूर्ण नहीं है, हम इसे आसानी से पेशी के लिए लंगर परिधीय नसों के सिरों रखकर क्षति के बिना STNS हटाने के लिए लगता है के बाद जब तक STG आसपास से काट दिया गया है ऊतक. यह STG और STN तना हुआ सुरक्षित और आसानी से मांसपेशियों और उन्हें आसपास के ऊतकों को हटाने के लिए पर्याप्त रहता है.
एक बार तैयारी स्पष्ट Sylgard पकवान में है, किसी भी ऊतक कि STNS पर रहता है के इलेक्ट्रोड के साथ एक प्रयोग के दौरान अपने हस्तक्षेप से बचने के लिए हटा दिया जाना चाहिए. यह भी आसान करने के लिए अच्छा है, स्थिर रिकॉर्डिंग जब तैयारी नीचे के रूप में संभव के रूप में तना हुआ नसों को क्षति के कारण के बिना टिकी है. यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है कि STG नीचे टिकी कम पिन के साथ करने के लिए संभव के रूप में कई कोशिकाओं के रूप में intracellular इलेक्ट्रोड पहुँच प्रदान alns द्वारा सुरक्षित हो. यह नसों कि STG रिकॉर्डिंग के लिए भी अगर उन नसों की जरूरत नहीं कर रहे हैं से उत्पन्न किसी के कम से कम हिस्सा काटना बेहतर है. वे अतिरिक्त आगे पकवान पर STG स्थिर एंकर प्रदान कर सकते हैं. यह सबसे अच्छा है के लिए उन्हें अधिकतम समर्थन के लिए काफी कम रखने.
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Acknowledgments
हम कृतज्ञता Marder लैब के सदस्यों को स्वीकार करते हैं. हम उसका समर्थन और प्रोत्साहन के लिए हमारे सलाहकार, डॉ. ईव Marder, धन्यवाद. इस शोध में मस्तिष्क संबंधी विकार के राष्ट्रीय संस्थान और स्ट्रोक एन एस +१७,८१३ और एन एस - 058,110 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Sylgard 170 | Other | Dow Corning | 170 | Gross Dissection |
| Fine Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Insect Pins size 6 | Surgery | Fine Science Tools | 26000-65 | |
| Mayo Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14110-17 | |
| Micro-Spatula | Surgery | WARD’s Natural Science | 15 V 4313 | |
| Rongeurs | Surgery | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Tissue Forceps | Surgery | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Surgery | California Fine Wire Company | Fine Dissection | |
| Forceps #5 | Surgery | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Surgery | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Surgery | Fine Science Tools | 15370-52 | |
| Petri Dish (100x15mm) | Other | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Pin Holder | Surgery | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Super fine forceps #5SF | Surgery | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Tungsten Needles | Surgery | Fine Science Tools | 10130-05 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Wild | MC3 | Misc. |
| Jonah Crab (C. borealis) | Animal | Commercial Lobster |
References
- Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , MIT Press. Boston. (1992).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).
- Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network. Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).
