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Biology

Cáncer de Borealis Stomatogastric disección del sistema nervioso

doi: 10.3791/1207 Published: March 23, 2009

Summary

El sistema nervioso stomatogastric (STNS) del cangrejo de Jonás (

Abstract

El ganglio stomatogastric (STG) es un excelente modelo para el estudio de las interacciones celulares y la red, ya que contiene un número relativamente pequeño de las células (aproximadamente 25 en C. borealis), que están bien caracterizados. Las células de la STG exhiben una amplia gama de productos y son responsables de las acciones motrices del estómago. El estómago contiene el molino gástrico, que descompone los alimentos con tres dientes internos, y el píloro, que filtra los alimentos antes de llegar al intestino. El STG produce dos salidas para controlar el ritmo del molino gástrico y el píloro conocido como generadores de patrones centrales (GPC). Cada celda de la STG se puede participar en uno o ambos de estos ritmos. Estas GPC permiten el estudio de la neuromodulación, la homeostasis, la variabilidad celular y de redes, desarrollo de redes, y la recuperación de la red.

La disección del sistema nervioso stomatogastric (STNS) del cangrejo de Jonás (cáncer borealis) se realiza en dos partes: la disección fina y gruesa. En la disección bruto de todo el estómago se diseca del cangrejo. Durante la disección fina del STNS se extrae del estómago usando un microscopio de disección y la disección de micro-herramientas (ver figura 1). El STNS incluye la STG, el ganglio esofágico (OG), y los ganglios de la comisura (COG), así como los nervios que inervan los músculos del estómago. Aquí, se muestra cómo realizar una disección completa de los STNS en la preparación de un experimento de electrofisiología en las células de la STG se registrará a partir de la célula y los nervios periféricos se utilizan para las grabaciones extracelular. La técnica adecuada para encontrar los nervios deseada se muestra, así como nuestra técnica de desheathing el ganglio para revelar la somata y neuropilo.

Protocol

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1. La disección bruto

  1. Coloque un cangrejo en hielo durante 30 minutos para calmar los sistemas sensoriales y motoras del animal. Lo rodean por todas partes con hielo. Se deben usar guantes al manipular el cangrejo.
  2. Prepararse para la disección bruto por colocar la bandeja de disección y las herramientas que va a utilizar. Gubias, tijeras de corte de hueso, pequeñas tijeras, pinzas dentadas, una espátula con un borde afilado, un plato negro Sylgard recubiertos, y los pernos de insectos son necesarios.
  3. Quitar el cangrejo del cubo de hielo por sus patas traseras para evitar pellizcos y colocarlo en la bandeja de disección.
  4. Quitar las garras por primera vez por cada giro hacia el interior una. A continuación, retire cada pierna con el mismo movimiento de torsión.
  5. Uso de la gubia, retire el maxilar superior que cubre la boca. También quite la maxillule suave.
  6. Uso de la gubia de nuevo, empezar desde el extremo lateral posterior del caparazón y obtener un buen agarre en el borde de la misma. Medidas drásticas con la gubia y romper ese trozo de caparazón de. Asegúrese de eliminar suficiente del caparazón para permitir la espátula para entrar en la apertura. Continuar con la eliminación del borde del caparazón, hasta los ojos y repetir en el otro lado.
  7. Con el lado afilado de la espátula, raspar suavemente el tejido interior suave contacto con el techo del caparazón dorsal. Mantenga la espátula en contacto con el caparazón para evitar dañar la STNS. Utilice la gubia de romper con las partes de la caparazón que han sido separados de los tejidos. También por separado algunos de los tejidos blandos de la caparazón ventral asegurarse de separar los músculos aductores de colocar el tejido de la caparazón.
  8. Romper el caparazón dorsal en lo posterior como el corazón, donde hay dos pequeños huesecillos que sobresale del caparazón. Cortar por lo anterior como sea posible. Estabilizar la Cephalon (la "cara") con un dedo, mientras que romper la parte más anterior del caparazón dorsal.
  9. En la parte ventral del caparazón, sacar la mandíbula a la vez, el anclaje de la gubia en la mandíbula, torciendo hacia el exterior para desalojar a la mandíbula de la epistome adjunta, y tirar a la basura. Dos huesecillos de largo con músculos deben estar unidos a la mandíbula extraída si se hace correctamente.
  10. Aparte el tejido de los lados de la Cephalon cerca de los ojos con la espátula. Con tijeras de disección pequeñas, atraviesan el tejido tan cerca de la cordillera de los huesecillos como capa por capa, es posible.
  11. El resto de cangrejo en una pared de la olla de disección y mantenerla hasta asegurarlo en su lugar (las garras se pueden utilizar para esto). Cortar el labrum ("el labio superior") de la epistome asegurándose de no dejar ningún tejido adherido. Utilizando tijeras de corte de hueso hacer dos cortes diagonales en el caparazón ventral para eliminar el Cephalon.
  12. Tome el labrum con pinzas dentadas y cortar el labio ("labio inferior") de la huesecillos en la parte ventral. A continuación, levante suavemente el labio lejos del caparazón ventral restantes. Use las tijeras pequeñas para separar la parte ventral del estómago del tejido que recubre el caparazón. Cuando las ampollas pilórica son visibles, cortes en el estómago fuera de los tejidos a ambos lados de la misma hasta que el estómago se extrae de los cangrejos.
  13. Todavía con el estómago por el labio con unas pinzas, descansar al estómago contra la palma de la mano y se vierte solución salina en la boca. Esto expande el estómago y hace que sea más fácil de abrir. Corte de la abertura de la boca hacia abajo entre el derecho a través del píloro huesecillos entre las ampollas. Luego se corta en diagonal hacia abajo a través de las dos ramas cardial. Cortar las puntas de los tres dientes en el interior del estómago.
  14. Coloque el estómago a un grande, negro, recubierto Sylgard plato con el interior del estómago hacia abajo. Precisar las cinco esquinas de la preparación con alfileres de insectos y llenar el recipiente con solución salina fría, sumergir toda la preparación (ver figura 1).

2. La disección fina

  1. , Micro-disección se necesitan instrumentos para la disección fina. En particular, pinzas y tijeras de primavera son necesarias, así como un soporte de pasador con una aguja de tungsteno. Un claro Sylgard recubiertos, placa de Petri y algunos pines de alambre fino también debería haber estado preparado.
  2. A partir del el aumento más bajo, comience por la fijación abajo las aletas cerca del borde que se utiliza para la apertura de la boca. Reorganizar el resto de los pines para hacer la preparación tensa y pin cualquier área que sea necesaria.
  3. Levante con cuidado la hipodermis vio que cubre la parte inferior de la preparación y el ajuste que a través de dejar un trozo de la hipodermis, con dos puntos blancos.
  4. Pelar el amarillo, el tejido ralo, membranosa en la parte inferior de la preparación. El mvns están débilmente unidas a la parte inferior de este tejido. Separe cuidadosamente los mvns del tejido amarillo que se levanta. Siga el tejido amarillo y corte junto con el cerebro.
  5. Seguir los procesos de espesor de salir del cerebro que se extienden laterally. Estos son los nervios commisural. Una vez que el extremo del nervio comisural se alcanza, quite la masa de esponjosa, blanco tejido que ha sido cortada de la parte del cerebro.
  6. Donde los iones y los hijos de cumplir con los engranajes, cortar el músculo y el tejido para revelar la duración de los iones y los hijos.
  7. Volver a la revisión de la hipodermis visto y lo cortó. Esto debería dejar una abertura en la arteria que rodea el STG. Corte a través de la apertura para separar los dos músculos que flanquean el STG. Levante los extremos de estos músculos y cortado a la derecha por debajo de ellos para separarlos de la arteria y para exponer la alns y agns. Separar los músculos que flanquean tan arriba como el cartílago que está sobre la STN.
  8. Cortar el tejido que rodea el STG arterial hasta donde el mvns, dgn, y dvn cumplir. Trabajar por la DVN a la LVNs y cortar a través del tejido blanquecino, delicada que cubre el LVN.
  9. Localice el PSN en los huesecillos en la parte inferior de la preparación. El PSN se puede utilizar para localizar el LVN y la unión dlvn.
  10. A continuación vienen las dlvn abajo para localizar el PYN y PDN. El PYN a menudo envuelve a la ampolla de la apertura del píloro. El PDN bifurca de la dlvn y se encuentra entre el píloro ampolla y los músculos cardio pilórica válvula. Deje un poco de músculo unido a uno de estos nervios, ya que pueden confundirse fácilmente cuando la preparación se transfiere a la clara fuente Sylgard.
  11. Una vez que todos los nervios se han descubierto, separar las conexiones entre el resto de STNS y los nervios del tejido no deseado y del estómago. Cuidadosamente mueva el STNS lejos del resto del estómago, cortando las conexiones perdidas.
  12. La condición del plato Sylgard claro con la masa restante de tejido del estómago por el roce sobre la superficie de la Sylgard hasta el Sylgard ya no se siente demasiado seca o pegajosa. Sylgard es hidrofóbica y la STNS se adhieren fuertemente a que si el plato Sylgard recubiertos no está condicionada de esta manera.
  13. Agregue un poco de solución salina fría para el plato. Coge los extremos superiores de los nervios comisurales con fórceps y llevar a los STNS a la clara fuente Sylgard.
  14. Pin de la STNS abajo sobre el Sylgard. Cortar el cerebro de los nervios comisurales y el uso de los pines minuten para asegurar los cuatro extremos de los engranajes en primer lugar. Asegúrese de que la preparación es la orientación adecuada, al verificar que la red IVN está apuntando hacia arriba fuera de la Sylgard. La DGN debería salir un poco por debajo de la STG, cuando el STG es lado derecho hacia arriba. Pin el resto de las terminaciones nerviosas hacia abajo con las patas de alambre fino.
  15. Limpie cualquier resto de músculo o tejido del STNS.
  16. Desheath la STG utilizando un soporte de pasador y un poco enganchado, con aguja fina, el tungsteno. Haz un pequeño agujero en un rincón de la vaina de STG lejos de los cuerpos celulares y el uso de ese agujero para llegar entre las capas de la vaina. Con cuidado, cortar una solapa de la cubierta separados para exponer el neuropilo STG y cuerpos celulares.
  17. Pin cualquier solapas de la cubierta hacia abajo para aumentar la accesibilidad a los cuerpos celulares y para estabilizar la STG de registros intracelulares. Re-pin el resto de la STNS asegurar que cada nervio se tensa y repartidas para el registro extracelular (ver figura 3).

3. Resultados

  1. Lo ideal sería que todos los nervios deben estar libres de rasguños y daños, en particular los que se registrarán a partir. Ninguno de los nervios deben ser enredado o retorcido. El STG debe estar intacto con todas las células dispuestas en forma de barbas de todo el neuropilo. El STNS intacta es de simetría bilateral y se ve como un homúnculo con la LVNs como las piernas, la mvns como los brazos y el extremo anterior de la cabeza.

Abreviaturas:

STNS Sistema nervioso Stomatogastric
STG Ganglio Stomatogastric
COG Ganglio comisural
OG Ganglio esofágico
mvn Nervio ventricular mediana
ion Los nervios del esófago inferior
hijo Los nervios del esófago superior
agn Nervio anterior del estómago
aln Nervio lateral anterior
dgn Nervio dorsal gástrico
dvn Nervio dorsal del ventrículo
LVN Nervio lateral del ventrículo
psn Los nervios del estómago posterior
PYN Nervio pilórica
PDN Nervio dilatador pilórica
dlvn Rama dorsal del nervio lateral del ventrículo
ivn Nervio inferior del ventrículo

"Figura

Figura 1: Diagrama que muestra la ubicación aproximada de la STNS en el estómago antes de la disección.

Figura 2

Figura 2: Diagrama de los distintos músculos en la parte inferior del estómago y una superposición de las STNS en verde claro. Cada tipo de célula en el STG está en la lista con los músculos que se sabe que inervan. Este mapa es útil en la planificación de la disección de un nervio que lleva la señal de una célula (cortesía del laboratorio de Nadim).

Figura 3
Figura 3: Diagrama esquemático de la STNS con electrodos intracelulares y extracelulares pozos (de Marder y Bucher, 2007).

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Discussion

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La disección STNS es el primer paso en la realización de un experimento de electrofisiología o inmunohistoquímica, o para la obtención de células para el cultivo celular. Independientemente del experimento previsto, la disección bruto se mantendrá sin cambios. Sin embargo, la disección fina puede variar. Es importante planificar de antemano que las células y los nervios que va a grabar desde. La mayoría de las neuronas en el STG tienen procesos que inervan al menos un músculo en el estómago (ver figura 2) y se clasifican de acuerdo a su objetivo inervado. Por lo tanto, las grabaciones extracelular están obligados a verificar plenamente la identidad de una célula que se está grabando intracelularmente. Frecuencia el ritmo del píloro y robustez se utilizan para supervisar la salud de la preparación. Por lo tanto, muchos experimentos incluyen grabaciones extracelular del LVN. La DGN es comúnmente utilizado para monitorear el ritmo gástrico. La STN es a menudo crucial para la mayoría de los experimentos, porque hay muchas células modulador en el extremo anterior de la STNS y la ruptura de ese nervio puede causar los ritmos del píloro gástrico y que cese o se vuelva irregular.

A pesar de que el orden en que los pasos de la disección fina se llevan a cabo no es importante, nos resulta más fácil de quitar sin dañar la STNS por mantener los extremos de los nervios periféricos anclada en el músculo hasta después de la STG se ha desconectado de los alrededores tejidos. Esto mantiene el suficiente STG y stn tensa para eliminar de forma segura y sencilla de los músculos y el tejido que los rodea.

Una vez que la preparación está en el plato Sylgard claro, cualquier tejido que queda en el STNS debe ser eliminado para evitar su interferencia con los electrodos durante un experimento. También es más fácil conseguir buenas grabaciones, estable cuando la preparación es precisado como tenso como sea posible sin causar daño a los nervios. Es particularmente importante que la STG fijarse de forma segura por el alns con alfileres cortos para proporcionar el acceso electrodos intracelulares a tantas celdas como sea posible. Es preferible diseccionar al menos parte de cualquiera de los nervios que se originan a partir de la STG, incluso si los nervios no son necesarios para la grabación. Ellos pueden proporcionar anclas extras más la estabilización de la STG en el plato. Lo mejor es mantenerlos relativamente corto para el máximo apoyo.

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Acknowledgments

Queremos agradecer a los miembros del Laboratorio de Marder. Agradecemos a nuestro asesor, el Dr. Marder Eva, por su apoyo y aliento. Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Apoplejía Becas NS y NS-17813-058110.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Black Sylgard 170 Other Dow Corning 170 Gross Dissection
Fine Scissors Surgery Fine Science Tools 14090-09
Insect Pins size 6 Surgery Fine Science Tools 26000-65
Mayo Scissors Surgery Fine Science Tools 14110-17
Micro-Spatula Surgery WARD’s Natural Science 15 V 4313
Rongeurs Surgery Fine Science Tools 16000-14
Tissue Forceps Surgery Fine Science Tools 11021-12
Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) Surgery California Fine Wire Company Fine Dissection
Forceps #5 Surgery Fine Science Tools 91150-20
Minuten Pins Surgery Fine Science Tools 26002-10
Moria Spring Scissors (7mm blades) Surgery Fine Science Tools 15370-52
Petri Dish (100x15mm) Other Fisher Scientific 08-757-12
Pin Holder Surgery Fine Science Tools 26018-17
Super fine forceps #5SF Surgery Fine Science Tools 11252-00
Sylgard 182 Other Dow Corning 182
Tungsten Needles Surgery Fine Science Tools 10130-05
Dissecting Microscope Microscope Wild MC3 Misc.
Jonah Crab (C. borealis) Animal Commercial Lobster

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References

  1. Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. MIT Press. Boston. (1992).
  2. Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
  3. Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268, (892), 161-220 (1974).
  4. Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network. Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).
<em>Cáncer de Borealis</em> Stomatogastric disección del sistema nervioso
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Cite this Article

Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection. J. Vis. Exp. (25), e1207, doi:10.3791/1207 (2009).More

Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection. J. Vis. Exp. (25), e1207, doi:10.3791/1207 (2009).

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