Summary
Det stomatogastric nervsystemet (STNS) av krabbtaska (
Abstract
Den stomatogastric ganglion (STG) är en utmärkt modell för att studera cellulära och nätverk interaktioner eftersom den innehåller ett relativt litet antal celler (ca 25 i C. borealis) som är väl karakteriserade. Cellerna i STG uppvisar ett brett utbud av utgångar och är ansvariga för motorn åtgärder i magen. Magen innehåller mag kvarnen som bryter ner maten med tre interna tänder och pylorus som filtrerar maten innan den når midgut. De STG producerar två rytmiska utgångar för att styra mag-kvarnen och pylorus kallas central mönsterritare (CPGs). Varje cell i STG kan delta i ett eller båda av dessa rytmer. Dessa CPGs göra det möjligt att studera neuromoduleringsteknik, homeostas, cellulär och nätverk föränderlighet, utveckling av nätet och nätverk återhämtning.
Dissekering av de stomatogastric nervsystemet (STNS) från krabbtaska (Cancer borealis) görs i två delar, de grova och fina dissekering. I grova dissektion hela magen är dissekeras från krabba. Under den fina dissektion av STNS utvinns från magen med en dissektion mikroskop och mikro-dissektion verktyg (se figur 1). I STNS ingår STG, det matstrupen ganglion (OG) och commissural ganglierna (COG) såväl som de nerver som innerverar magen muskler. Här visar vi hur du utför en fullständig dissekering av STNS inför en elektrofysiologi experiment där de celler i STG skulle spelas in från intracellulärt och perifera nerver skulle användas för extracellulärt inspelningar. Den rätta tekniken för att hitta önskad nerverna visas samt vår teknik desheathing de ganglion att avslöja somata och neuropil.
Protocol
1. Gross Dissection
- Placera en krabba på is i 30 minuter för att döva sensoriska och motoriska system av djuret. Omger den på alla sidor med is. Handskar ska användas vid hantering av krabba.
- Förbered för grov dissektion genom att lägga ut dissektion pannan och de verktyg du använder. Rongeurs är ben skär sax, en liten sax, tandad pincett, en spatel med en avsmalnande kant, en svart Sylgard-belagd skålen och insekter stift behövs.
- Ta bort krabba från ishinken av dess bakben för att förhindra att klämmande och placera den i dissekering pannan.
- Ta bort klor först genom att vrida var och en inåt. Ta sedan bort varje ben med samma vridande rörelse.
- Använda rongeurs, ta bort maxilla täcker munnen. Ta också bort den mjuka maxillule.
- Använda rongeurs igen, börja om från laterala bakre änden av ryggskölden och få ett bra grepp på kanten av det. Spänn fast med rongeurs och bryta denna del av ryggskölden av. Se till att ta bort nog av ryggskölden att låta spateln för att komma in i öppningen. Fortsätt att ta bort kanten av ryggskölden upp till ögonen och upprepa på andra sidan.
- Med den koniska sidan av spateln, försiktigt skrapa den mjuka inre vävnad bort från taket på rygg-skölden. Håll stekspade i kontakt med skölden för att undvika skador på STNS. Använd rongeurs att bryta sig loss de delar av skölden som har skilts från vävnaden. Även separata del av mjukvävnad från ventrala ryggskölden och se till att skilja eventuella adduktorer fästa vävnad till ryggskölden.
- Bryt bort dorsala ryggskölden så långt posterior som hjärtat där det finns två små hörselbenen sticker ut från ryggskölden. Klipp så långt anterior som möjligt. Stabilisera Cephalon (det "ansikte") med ett finger samtidigt bryta bort de mest främre delarna av rygg-skölden.
- På den ventrala sidan av ryggskölden, dra ut mandibles en i taget genom att förankra rongeurs på en underkäken, vrida dem utåt för att lossa underkäken från bifogade epistomen, och dra bort den. Två långa hörselbenen med muskler bör knytas till den extraherade underkäken om det görs på rätt sätt.
- Separera bort vävnad från sidorna av Cephalon nära ögonen med hjälp av spateln. Med små dissektion saxar, skär tvärs över vävnaden så nära kanten av LITET BEN som möjligt lager för lager.
- Vila krabban mot en vägg av dissekering pannan och stötta upp säkra den på plats (klor kan användas för detta). Skär labrum ("upper lip") från epistomen se till att inte lämna några vävnad bifogas. Använda ben skär sax göra två diagonala snitt i ventrala ryggskölden för att ta bort Cephalon.
- Ta labrum med tandade pincett och skär labium ("underläppen") från LITET BEN på den ventrala sidan. Sedan försiktigt lyfta läppen bort från de återstående ventrala ryggskölden. Använd en liten sax för att separera den ventrala delen av magen från vävnaden foder ryggskölden. När pyloric ampullae är synliga, skär magen bort från vävnaden på båda sidor om det tills magen är ur krabba.
- Fortfarande håller magen i läppen med pincett, vila magen mot handflatan och häll saltlösning i munnen. Detta expanderar magen och gör det lättare att skära upp. Klipp från öppningen vid mynningen ner mellan pylorus rakt igenom LITET BEN mellan ampullae. Sen skär snett ner genom de två cardial grenarna. Skär av topparna av tre tänder insidan av magen.
- Placera magen på en stor, svart, Sylgard belagda maträtt med insidan av magen ner. Pin ner fem hörnen av preparatet med insekten stift och fyll skålen med kall koksaltlösning, doppa hela beredningen (se figur 1).
2. Fin Dissection
- , Micro-dissektion verktyg behövs för de fina dissekering. I synnerhet pincett och sax våren behövs samt en pin hållare med en volfram nål. En tydlig, Sylgard-belagd, petriskål och fina pins tråd borde också ha tagits fram.
- Början på lägsta förstoringen, börja med att nåla ner flikarna nära läppen som brukade vara munnen öppnas. Ordna resten av stiften för att göra förberedelser spända och pin alla andra områden som är nödvändiga.
- Lyft försiktigt fläckig underhuden som täcker den nedre delen av förberedelserna och trimma den över lämnar en lapp i underhuden med två vita prickar.
- Skala upp gula, stripig, membranös vävnad nära botten av preparatet. Den mvns är svagt monteras på undersidan av denna vävnad. Separera försiktigt mvns från gul vävnaden när den dras upp. Följ den gula vävnaden upp och skär tillsammans med hjärnan.
- Följ den tjocka processer spännande hjärnan som sträcker laterally. Dessa är de commisural nerverna. När slutet av commissural nerv är nådd, ta bort massa svampiga, natur vävnad som har klippts bort från den sida av hjärnan.
- Om joner och söner möta kuggar, skära bort de muskler och vävnad för att avslöja längd joner och söner.
- Återgå till den fläckiga underhuden plåster och skär bort det. Detta bör lämna en öppning i artären som omger STG. Skär genom öppningen för att separera de två musklerna som flanken av STG. Lyft upp ändarna på dessa muskler och skär rätt under dem att skilja dem från artär och att exponera alns och agns. Separera kompletterande muskler så långt upp som brosket liggande över STN.
- Skär bort de arteriella vävnaden som omger STG ner till där mvns, DGN och DVN möts. Arbeta ner DVN till lvns och skär genom vitaktig, känsliga vävnaden som täcker lvns.
- Leta reda på PSN över LITET BEN nära botten av preparatet. PSN kan användas för att lokalisera LVN och dlvn korsning.
- Nästa följa dlvn ner för att hitta den pyn och PDN. Den pyn sveper ofta över pyloric ampulla till öppningen. Den PDN gafflar bort av dlvn och är mellan pyloric ampulla och hjärt pyloric musklerna ventil. Lämna lite muskler knutna till någon av dessa nerver, eftersom de lätt kan förväxlas när beredningen överförs till den klara Sylgard skålen.
- När alla nerver har upptäckts, bryta eventuella kvarvarande anslutningar mellan STNS och vävnaden och oönskade nerver i magen. Försiktigt flytta STNS bort från resten av magsäcken, kapar några missade anslutningar.
- Tillstånd klart Sylgard skålen med de övriga massan av magen vävnad genom att gnugga den över ytan av Sylgard tills Sylgard inte längre känns för klibbig eller torr. Sylgard är hydrofoba och STNS ska följa starkt till det om Sylgard-belagda maträtt inte är villkorat på detta sätt.
- Lägg till några kall koksaltlösning för att skålen. Ta den övre ändar commissural nerver med pincett och föra STNS den klara Sylgard skålen.
- Nåla fast STNS ner på Sylgard. Sever hjärnan från commissural nerver och använda minuten stiften för att säkra de fyra ändarna av kuggar ner först. Se till att beredningen är rätt sida upp genom att kontrollera att IVN pekar uppåt bort från Sylgard. Den DGN ska avsluta något under STG när STG är högra sidan uppåt. Pin resten av nervändar ner med den fina tråden stift.
- Torka bort eventuell kvarvarande muskel eller vävnad från STNS.
- Desheath på STG använda ett stift hållare och en något fast, fin, volfram nål. Gör ett litet hål i ett hörn av STG slida bort från cellen organ och använda det hålet för att få mellan lagren av skidan. Skär försiktigt en flik av separerade slida att exponera STG neuropil och organ cell.
- Pin några lappar med slida ner för att öka tillgängligheten till cellen organ och att stabilisera STG för intracellulära inspelningar. Re-pin resten av STNS se till att varje nerv är stram och väl placerade för extracellulärt inspelning (se figur 3).
3. Resultat
- Helst bör alla nerver vara fri från skråmor och skador, särskilt de som kommer att spelas in från. Ingen av de nerver ska trassla eller vriden. Den STG ska vara intakt med alla celler arrangerade i ett skägg formation runt neuropil. Den intakta STNS är bilateralt symmetriska och ser ut som en homunculus med lvns som benen, mvns som armar och den främre änden som chef.
Förkortningar:
| STNS | Stomatogastric nervsystemet |
| STG | Stomatogastric ganglion |
| KUGGE | Commissural ganglion |
| OG | Esofageal ganglion |
| mvn | Median ventrikulär nerv |
| ion | Sämre matstrupen nerv |
| son | Överlägsen matstrupen nerv |
| AGN | Anterior gastric nerv |
| ALN | Anterior lateral nerv |
| DGN | Dorsal gastric nerv |
| DVN | Dorsal ventrikulär nerv |
| LVN | Lateral ventrikulär nerv |
| PSN | Posterior magen nerv |
| pyn | Pyloric nerv |
| PDN | Pyloric dilator nerv |
| dlvn | Dorsal gren av den laterala ventrikulära nerv |
| IVN | Sämre ventrikulär nerv |
Figur 1: Diagram som illustrerar den ungefärliga placeringen av STNS i magen före dissekering.
Figur 2: Diagram över de olika musklerna i nedre delen av magen och en överlagring av STNS i ljusgrönt. Varje celltyp i STG är noterat med musklerna de är kända innerverar. Den här kartan är till hjälp när man planerar att dissekera en nerv som bär en signal från en viss cell (artighet av Nadim lab).
Figur 3: Schematisk beskrivning av STNS med intracellulära elektroder och extracellulära brunnar (från Marder och Bucher, 2007).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den STNS dissektion är det första steget för att utföra en elektrofysiologi eller immunohistokemi experiment, eller för att få celler för cellodling. Oavsett den avsedda experiment kommer bruttomarginalen dissektion förblir oförändrade. Dock får den fina dissektion variera. Det är viktigt att planera i förväg vilka celler och vilka nerver du kommer att spela in från. De flesta nervceller i STG har processer som innerverar minst en muskel i magen (se figur 2) och klassificeras enligt deras innerveras mål. Därför är extracellulär inspelningar krävs för att fullständigt kontrollera identiteten på en cell som spelas in intracellulärt. Den pyloric rytmens frekvens och robusthet används för att övervaka hälsan av preparatet. Därför många experiment inkluderar extracellulära inspelningar från LVN. Den DGN används ofta för att kontrollera mag-rytm. Den STN är ofta avgörande för de flesta experiment eftersom det finns många begränsande celler i främre änden av STNS och kapning av att nerven kan orsaka pyloric och mag rytmer att upphöra eller bli oregelbunden.
Även om i vilken ordning stegen i den fina dissektion sker är inte viktigt, finner vi det lättare att ta bort STNS utan skador genom att hålla i ändarna av perifera nerver förankras i muskeln förrän STG har kopplats loss från den omgivande vävnad. Detta håller STG och STN spänd nog för att säkert och enkelt ta bort musklerna och vävnaden som omger dem.
När förberedelserna är i klar Sylgard skålen, bör alla vävnad som finns kvar på STNS tas bort för att undvika sin inblandning med elektroderna under ett experiment. Det är också lättare att få bra, stabil inspelningar när preparatet nålas ner så spänd som möjligt utan att orsaka skador på nerver. Det är särskilt viktigt att STG ska nålas ner ordentligt av alns med korta stift att ge intracellulära elektroder tillgång till så många celler som möjligt. Det är bättre att dissekera ut åtminstone en del av någon av de nerver som kommer från STG även om dessa nerver inte behövs för inspelning. De kan ge extra ankare ytterligare stabilisera STG på skålen. Det är bäst att hålla dem ganska kort för maximalt stöd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi erkänner tacksamt medlemmar i Marder Lab. Vi tackar vår handledare, Dr Eva Marder, för hennes stöd och uppmuntran. Denna forskning stöds av National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke Grants NS-17.813 och NS-058.110.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Sylgard 170 | Other | Dow Corning | 170 | Gross Dissection |
| Fine Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Insect Pins size 6 | Surgery | Fine Science Tools | 26000-65 | |
| Mayo Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14110-17 | |
| Micro-Spatula | Surgery | WARD’s Natural Science | 15 V 4313 | |
| Rongeurs | Surgery | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Tissue Forceps | Surgery | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Surgery | California Fine Wire Company | Fine Dissection | |
| Forceps #5 | Surgery | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Surgery | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Surgery | Fine Science Tools | 15370-52 | |
| Petri Dish (100x15mm) | Other | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Pin Holder | Surgery | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Super fine forceps #5SF | Surgery | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Tungsten Needles | Surgery | Fine Science Tools | 10130-05 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Wild | MC3 | Misc. |
| Jonah Crab (C. borealis) | Animal | Commercial Lobster |
References
- Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , MIT Press. Boston. (1992).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).
- Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network. Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).
