出芽酵母の複製寿命の測定

Summary

この記事では、酵母の母細胞の複製寿命を測定するための一般的なプロトコルを提示する。

Abstract

老化は細胞成分と死亡率をもたらす細胞内小器官の進行性の悪化によって特徴付け変性過程です。出芽酵母

Protocol

パート1：複製の寿命解析のための準備菌株とプレート

このセクションでは、複製寿命の実験と寿命解析のための酵母細胞の調製のための固体YEPDプレートの準備について説明します。

1. 適切な無菌操作を使用して、培養の酵母細胞および複製寿命解析のために使用されるYEPD寒天プレート（1％酵母エキス、2％バクト - ペプトン、2％寒天、2％グルコース）を準備。あなたは、寿命の実験で分析するすべての4から5株のために少なくとも2枚を準備する必要があります。プレートは、少​​なくとも2日間の寿命の実験の前に準備し、寿命のアッセイを開始する前に乾燥させる必要があります。実験はプレートを注ぐの4-5日以内に開始されない場合は、冷蔵インキュベーター内に配置し、dessicationを防ぐためパラフィルムやプラスチックでラップする必要があります。
2. YEPD寒天プレート上に単一のコロニーのために凍結ストックとストリークから酵母株を取り外します。最大6系統まで簡単に同じ大きさの扇形のウェッジに板を分割することによって同じYEPDプレートにストリークすることができます。
3. 2日間、30℃で細胞をインキュベートする。
4. 新鮮なYEPDプレート上にインキュベーターと単一コロニーからのパッチの細胞から細胞を取り除きます。二つの異なるコロニーからの2つのパッチが各菌株に生成される必要があります。この時点では、分析対象の菌株は、解析部は、個々の菌株の身元がわからないどこに複製寿命の実験は、"ブラインド"が実行されるようにコーディングする必要があります。
5. 次の夜まで30でパッチが適用され、コード化された細胞℃でインキュベートする。
6. 複製寿命の解析に使用される実験的な板となる新鮮なYEPDプレートに各符号化された株からの細胞と軽くパッチの細胞を、取り外します。細胞は、YEPDプレート（図1）の左側の縦線に沿ってパッチを適用する必要があります。プレート当たり約3〜5のパッチはそれぞれのパッチから20セルの複製寿命の解析を想定し、最適です。これは彼らのその後の複製寿命を制限する可能性が、細胞は一晩のインキュベーションの間に厚く成長させる原因となります、新鮮なYEPDプレートに多数のセルを転送する（どちらが望ましい）必要はありません。
7. ベンチの上に一晩たてのパッチを適用したプレートをインキュベートする。

パート2：複製の寿命解析のための位置のセル。

このセクションでは、酵母のプレート上の細胞とどのように複製の寿命解析のための処女の娘細胞を取得するために配置する方法について説明します。この時点から、すべてのプレートがdessicationを防ぐために、解剖を受ける場合を除き、parafilmedされるべきである。

1. 酵母に適したマイクロダイセクション装​​置を装備した顕微鏡を使用して、パッチを適用したセルに遠位プレート上に位置する最初のパッチを適用した菌株から約50細胞を移す。あなたの顕微鏡ステージが傾斜している場合、これらの階調は、細胞は、その後の反復中に見つけることは容易であることを保証するために使用することができます。ツァイスのAxioscope 40、最初のパッチを適用した菌株からの細胞は、座標90 × 10で配置することができるとそこから垂直に配列した。
2. 繰り返し寒天表面に触れることにより、細胞の針をきれいにし、寒天表面から針を強制することで、寒天に穴を作成します。この穴は、解剖し、娘細胞の除去のその後の反復中にプレート上に向けますあなたにマーカーとして機能します。穴の中に酵母細胞を得るために、または彼らが成長するとコロニーを形成しないように注意してください。
3. 直接穴の上に、垂直方向に各セルの位置（図1）の間に1〜3針の直径（〜100μM）で、20の等間隔の位置に個々の酵母細胞を合わせます。すべてのいくつかの細胞は、1つではなく複数行の同じ位置で互いに隣接する2つのセルを置きます。導入細胞のいずれかの分割に失敗した場合、これは、処女の娘のセルの選択時に冗長性が可能になります。
4. ^第 10 ^回と行の11 ^番目の位置の間に、寒天で7〜8穴の水平方向の系列を作成。これは解剖と娘細胞の除去の以降の反復中に、プレート上に向けますあなたにマーカーとして機能します。穴の酵母細胞を得るために、または彼らが成長するとコロニーを形成しないように注意してください。
5. 同じ軸に沿って垂直に配列のセルに続けて、プレート上の各パッチの手順2.1から2.4を繰り返します。ステップ2.2の場合は、作成された穴の数は、パッチ番号（最初のパッチ用の穴、第二の2つの穴、等）に対応している必要があります。
6. 一度細胞をパラフィルムは、30のプレートとインキュベートは℃で約2時間、各パッチに配列されています。
7. 実験における各プレートの手順2.1から2.6を繰り返します。

パート3：寿命解析のための取得処女の娘細胞

このセクションでは、各セルは、処女の娘として始まるようにすることで、寿命の解析を開始するセル。

1. インキュベータからプレートを取り外し、アレイの細胞のほとんどは細胞分裂を受けていることを確認してください。追加の時間は細胞分裂が完了できるようにするために必要な場合は、インキュベーターにプレートを返します。
2. 第一アレイのセルから始めて、穏やかに接続されたセルの上に針を置くことによって母細胞から娘細胞を切り離すために針を使用してください。それは、針が細胞に休んでいる間に、顕微鏡ベースの側をタップすると便利な場合があります。
3. 母細胞と任意の追加の娘細胞を交換すると一時的に脇に移動させる垂直線で分離された娘細胞を、置きます。
4. アレイのセルの各々3.2と3.3を繰り返します。細胞の分裂に失敗した場合は、ステップ2.3に位置付け冗長な細胞の一つから娘細胞を取る。終了すると、寿命のプレートに垂直配向各パッチのための20の娘細胞が必要です。
5. 山に母細胞と余分な娘細胞のすべてを収集し、パッチ付近（"墓場"）に戻ってそれらを転送する。遠くmicrocoloniesと地元の栄養素の枯渇の形成を防止するために寿命の解析を起こしている細胞から不要な細胞を維持することが重要です。
6. パラフィルムで約2時間、30℃でプレートをインキュベート。
7. 実験における各プレートの手順3.2から3.6を繰り返します。

パート4：個々の細胞の複製能力を測定する

1. 寿命のデータシートを準備します。寿命のデータシートは、各行が個々の母細胞に対応し、各列は、年齢の点（図2）に対応するシンプルなグリッドにすることができます。分析する菌株の数に応じて各データシートにラベルを付けます。
2. インキュベータからプレートを取り外し、アレイ細胞のほとんどは、少なくとも1つの細胞分裂を受けていることを確認してください。追加の時間は細胞分裂が完了できるようにするために必要な場合は、インキュベーターにプレートを返します。
3. 最初のプレートの最初のアレイのセルから始めて、視覚的に母と娘細胞（s）を観察し、発生したセルの分割数を決定します。母は、セルの配置の特徴的なパターンに基づいて、生産しているか、多くの娘細胞を判別することは簡単です。寿命のスコアシート上の適切なボックスに、母細胞により産生される娘細胞の数を記録。
4. ステップ3.2で説明したように母細胞から娘細胞を切り離すために針を使用してください。
5. 垂直線内での位置の母細胞を保持し、脇に一時的に娘細胞（複数可）を移動する。
6. アレイの各セルのためのステップ4.3から4.5を繰り返します。
7. 破棄された娘細胞のすべてを収集し、オリジナルのパッチの近くにある"墓地"、に移動します。
8. パラフィルム30でプレートとインキュベートします2〜3時間のためのC。
9. 実験における各プレートの手順4.3から4.8を繰り返します。
10. すべての母細胞が分裂を停止するまで繰り返し、4.2から4.9を繰り返します。母細胞の年齢として、細胞周期の進行が遅くなり、それは年齢の点の間の時間の長い期間のためのプレートをインキュベートすることが望ましいでしょう。プレートを4℃で一晩置くことができます。

パート5：代表的な結果。

複製寿命の実験によって生成される生データは、各年齢ポイント（図2）でそれぞれ母細胞により産生される娘細胞に対応するリストの番号です。スコアシートの各列を合計することによって、各母細胞のための複製の寿命が得られる。同じ実験群から母細胞のためのデータは、生存曲線（図3A）を生成すると、平均寿命、平均寿命のスパン、および標準偏差などの統計計算を実行するためにプールすることができます。このようなWilcoxonの順位和検定などのノンパラメトリック検定は、、寿命に大きな違いは、実験群の間で検出されたかどうかを決定するために実行することができます。実験が正しく動作するときに、生存曲線は、生存に比較的急速に減少し、曲線のフラット化から後で年齢を続けて低い早期死亡率とシグモイドSHAPを示すゴンペルツ-メイカム速度とほぼ一致している必要があります。この範囲の変化の外側が報告されているが、ほとんどの野生型株は、20〜30世代の範囲内の複製寿命の値を持ちます。

図1。典型的な複製の寿命のプレートの図 。酵母細胞のマイクロダイセクションを開始する前に、夕方は、3〜5株が軽くプレートの片側に沿って垂直線のYEPDプレート（赤箱）の表面にパッチが適用されます。一晩成長に続いて、各菌株から約30個々の細胞を20の位置を含む行に垂直に配列される。ライフスパンanalysisはこれらの初期の細胞から得られたVバージンの娘細胞に実行されます。実験（例えば、不要な娘細胞）中にマイクロダイセクションから得られた余分な細胞は、コロニーが形成される栄養素のローカル枯渇を避けるために、遠く離れた実験的な細胞から離れている"墓場"（灰色の楕円形）に配置されます。

図2。複製寿命タリーシート。複製寿命の実験からの生データが表示されます。各行は、単一の酵母の母細胞に対応し、各列は、年齢の点に対応しています。各ボックスに入力した番号は、その年齢時点でその母細胞により産生される娘細胞の数です。各菌株は、酵母細胞を解剖し、個々に分析される株の同一性の知識がないようにコード化された番号が付いています。二十細胞はそれぞれの菌株を検定されています。

図3。複製寿命の実験から代表的な生存と成長曲線。（A）の生存曲線は、（B）の成長曲線をプロットすることによって得られる（細胞分裂の数。複製年齢の関数としてまだ生きている母細胞の割合をプロットして得られる年齢の点の関数として与えられたひずみによって生じる娘細胞の平均数はこの例では、歪＃2が長い長寿命ですが、遅いなどの成長プロットの減少初期勾配から明らかなように、成長を続けている。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Reagent	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Bacto-Peptone	Reagent	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
Yeast Extract	Reagent	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)
Glucose