Medición de Span replicativa vida en la levadura en ciernes

Summary

En este artículo presentamos un protocolo general para la medición de la duración de la vida replicativa de las células madre de la levadura.

Abstract

El envejecimiento es un proceso degenerativo caracterizado por un deterioro progresivo de los componentes celulares y orgánulos que resulta en la mortalidad. La levadura en ciernes

Protocol

Parte 1: Preparar las cepas y las placas para el análisis de la vida replicativa lapso

En esta sección se describe la preparación de las placas de YEPD sólida para su uso en el experimento de replicación vida y la preparación de las células de levadura para el análisis de vida útil.

1. Utilizando una técnica estéril su caso, preparar las placas de agar YEPD (1% extracto de levadura, 2% Bacto-peptona, 2% de agar, 2% de glucosa) que será utilizado para el cultivo de células de levadura y para el análisis abarcan replicativa vida. Usted debe preparar por lo menos dos placas por cada 4-5 cepas para ser analizados en el experimento de vida. Las placas deben estar preparados por lo menos 2 días antes del experimento esperanza de vida y se deja secar antes de comenzar el ensayo de vida útil. Si el experimento no se iniciará dentro de 4-5 días de verter las placas, deben ser colocados en una incubadora refrigerada y envuelto en parafina o plástico para evitar la desecación.
2. Eliminar las cepas de levadura de las existencias congeladas y racha de colonias aisladas en placas de agar YEPD. Hasta 6 cepas pueden ser sembradas en la placa de YEPD mismo mediante la separación de la placa de igual tamaño en forma de pastel cuñas.
3. Se incuban las células a 30 ° C durante 2 días.
4. Eliminar las células de la incubadora y las células de parches de una sola colonia en una placa de YEPD fresco. Dos parches de dos colonias diferentes se deben generar para cada cepa. En este momento, las cepas a analizar deben ser codificados para asegurar la vida replicativa experimento lapso se lleva a cabo "a ciegas", donde los disectores no conocer la identidad de las distintas cepas.
5. Se incuban las células parcheado, codificado a 30 ° C hasta la noche siguiente.
6. Eliminar las células y las células de la ligera revisión de cada cepa codificados a nuevas placas de YEPD, que servirá como las placas experimentales utilizados para el análisis de ciclo de vida replicativa. Las células deben ser reparado a lo largo de una línea vertical en el lado izquierdo de la placa de YEPD (Figura 1). Aproximadamente 3-5 parches por placa es óptimo, asumiendo la vida replicativa análisis abarcan el 20 de células de cada parche. No es necesario (ni deseable) para transferir un gran número de células a la placa de YEPD fresco, ya que esto hará que las células crezcan densamente durante la incubación durante la noche, lo cual puede limitar su tiempo de vida posterior replicación.
7. Las placas se incuban durante la noche recién parcheado en la mesa de trabajo.

Parte 2: Posición de las células para el análisis de intervalo de replicación vida.

En esta sección se describe cómo la posición de las células de levadura en el plato y la forma de obtener células virgen hija de análisis abarcan replicativa vida. A partir de ahora, todas las placas deben ser parafilmed, excepto cuando se someten a la disección, con el fin de prevenir la desecación.

1. El uso de un microscopio equipado con un aparato de microdisección adecuado para la levadura, la transferencia de aproximadamente 50 células de la cepa parche primero en una posición en la placa distal a las células del parche. Si la platina del microscopio se clasifica, estos matices se puede utilizar para asegurarse de que las células serán fáciles de encontrar en las siguientes iteraciones. En la Axioscope Zeiss de 40 años, las células de la cepa parche primero se puede colocar en las coordenadas 90 x 10 y dispuestos verticalmente desde allí.
2. Limpie la aguja de las células en varias ocasiones de tocar la superficie del agar, a continuación, crear un agujero en el agar al forzar la aguja a través de la superficie del agar. Este agujero servirá como un marcador para orientarse en el plato durante las siguientes iteraciones de la disección y la eliminación de células hija. Tenga cuidado de no obtener las células de levadura en el agujero, o que crecen y se forma una colonia.
3. Directamente sobre el agujero, alinear verticalmente células individuales de levadura en 20 puntos espaciados uniformemente, con un diámetro de aguja 1-3 (~ 100 M) entre cada posición de la célula (Figura 1). Cada pocas células, coloque dos células adyacentes en la misma posición en la línea en lugar de uno. Esto permite la redundancia en la selección virgen célula hija, si una de las células transferidas no para dividir.
4. Entre ^el 10 y 11 ^º puestos en la línea, crear una serie horizontal de 7-8 agujeros en el agar. Esto servirá como un marcador para orientarse en el plato durante las siguientes iteraciones de la disección y la eliminación de células hija. Tenga cuidado de no obtener células de levadura en los agujeros, o crecen y se forma una colonia.
5. Repita los pasos 2.1 a 2.4 por cada parche en el plato, sin dejar de celdas del arreglo verticalmente a lo largo del mismo eje. Para el paso 2.2, el número de agujeros creados deben corresponder a la cantidad de parches (un agujero para el primer parche, dos agujeros para el segundo, etc.)
6. Una vez que las células han sido dispuestos para cada parche, la placa de parafina y se incuba a 30 ° C durante aproximadamente 2 horas.
7. Repita los pasos 2.1-2.6 por cada placa en el experimento.

Parte 3: Obtener células virgen hija para el análisis de vida útil

En esta sección se iniciará el análisis de ciclo de vida, asegurando que cada célula se inicia como una hija virgencelular.

1. Retire las placas de la incubadora y verificar que la mayoría de las células dispuestas han sido sometidos a una división celular. Si se necesita más tiempo para permitir que la división celular que se complete, la placa de retorno a la incubadora.
2. A partir de las células dispuestas en primer lugar, el uso de la aguja para separar las células hija de la célula madre colocando suavemente la aguja en la parte superior de las células unidas. A veces es útil para aprovechar el lado de la base del microscopio, mientras que la aguja está en reposo en las células.
3. Coloque la célula hija separada de la línea vertical, en sustitución de la célula madre y las células hijas más y moverlos de lado temporalmente.
4. Repita el paso 3.2 y 3.3 para cada una de las células dispuestas. Si una célula no puede dividirse, tomar una célula hija de una de las células redundantes posicionado en el paso 2.3. Cuando haya terminado, usted debe tener 20 células hijas de cada parche alineados verticalmente sobre la placa de vida.
5. Recoge todas las células madre y células adicionales hija en una pila y la transferencia de nuevo a una zona cercana a los parches ("el cementerio"). Es importante evitar que las células no deseadas lejos de las células en proceso de análisis vida útil para prevenir la formación de microcolonias y el agotamiento de los nutrientes local.
6. Parafilm la placa y se incuba a 30 ° C durante aproximadamente 2 horas.
7. Repita los pasos 3.2-3.6 por cada placa en el experimento.

Parte 4: Medición de la capacidad replicativa de las células individuales

1. Prepare la vida de los datos abarcan las hojas. Una esperanza de vida hoja de datos puede ser una simple rejilla donde cada fila corresponde a una célula madre individual y cada columna corresponde a una edad más puntos (Figura 2). La etiqueta de cada hoja de datos en función del número de cepas para ser analizados.
2. Retire las placas de la incubadora y verificar que la mayoría de las células dispuestas han sufrido al menos una división celular. Si se necesita más tiempo para permitir que la división celular que se complete, la placa de retorno a la incubadora.
3. A partir de la primera celda dispuestas en la primera placa, observe la célula madre y la hija (s) y determinar el número de divisiones celulares que han ocurrido. Por lo general, fácil de determinar el número de células de la hija de una madre ha producido, sobre la base de los patrones característicos de los acuerdos de la célula. Anote el número de células hijas producidas por la célula madre en la casilla correspondiente en la hoja de vida cuenta tramo.
4. Utilice la aguja para separar las células hijas de la célula madre como se describe en el paso 3.2.
5. Conservar las células madre en su posición en la línea vertical y mover la célula hija (s) a un lado temporalmente.
6. Repita los pasos 4.3-4.5 para cada una de las células dispuestas.
7. Recoge todas las células hijas descartados y pasar a la "cementerio", situado cerca de los parches originales.
8. Parafilm la placa y se incuba a 30 ° C durante 2-3 horas.
9. Repita los pasos 4.3-4.8 por cada placa en el experimento.
10. Repita los pasos 4.2 a 4.9 hasta que todas las células madre han dejado de dividirse. A medida que la edad de la madre las células, la progresión del ciclo celular se vuelve más lento y sería deseable que se incuba la placa durante períodos más largos de tiempo entre la edad de los puntos. Las placas se pueden colocar a 4 ° C durante la noche.

Parte 5: Los resultados representativos.

Los datos en bruto producido por un experimento de replicación vida es una lista de números correspondientes a las células hijas producidas por cada célula madre en cada etapa de punto (Figura 2). Por la suma de cada fila de la hoja de puntuación, la duración de la vida replicativa de cada célula madre se obtiene. Los datos de las células madre del grupo experimental misma pueden ponerse en común para generar una curva de supervivencia (Figura 3) y para realizar cálculos estadísticos, tales como vida media, tiempo de vida media y la desviación estándar. Una prueba no paramétrica, como el Wilcoxon test, se puede realizar para determinar si las diferencias significativas en la duración de la vida se han detectado entre los grupos experimentales. Cuando el experimento funciona correctamente, la curva de supervivencia debe ser más o menos consistente con Gompertz-Makeham cinética sigmoidal mostrando un shap con la mortalidad temprana baja siguió un descenso relativamente rápido de la supervivencia y un aplanamiento de la curva de la edad de la tarde. La mayoría de las cepas salvajes han replicativa valores de esperanza de vida en el rango de la generación 20-30, aunque fuera de la variación de esta gama ha sido reportado.

Figura 1. Diagrama de una placa lapso replicativa típica vida. La noche antes de comenzar la microdisección de células de levadura, 3-5 cepas son ligeramente parcheado en la superficie de una placa de YEPD (cajas de color rojo) en una línea vertical a lo largo de un lado de la placa. Después de un crecimiento durante la noche, aproximadamente 30 celdas individuales de cada cepa se ordenan verticalmente en una línea que contiene 20 posiciones. Esperanza de vida analysis se llevará a cabo en las células v hija virgen obtenido de estas células iniciales. Las células adicionales que se obtienen a partir de microdisección durante el experimento (por ejemplo, las células hijas no deseados) son colocados en "el cementerio" (óvalo gris), que se encuentra lejos de las células experimentales con el fin de evitar el agotamiento local de nutrientes, como las colonias se forman.

Figura 2. Una vida replicativa lapso hoja de registro. Los datos brutos de un experimento de vida replicativa se muestra. Cada fila corresponde a una célula de levadura madre soltera y cada columna corresponde a una edad más puntos. El número de inscritos en cada casilla es el número de células hijas producidas por que la célula madre a esa edad-punto. Cada cepa se etiqueta con un número codificado de tal manera que el individuo la disección de las células de levadura no tiene conocimiento de la identidad de las cepas que se analiza. Veinte células se analizan para cada cepa.

Figura 3. Representante de la supervivencia y las curvas de crecimiento de un experimento de vida replicativa. (A) Las curvas de supervivencia se obtienen mediante el trazado de la fracción de células madre aún vive en función de la edad de replicación (número de divisiones celulares. (B) Las curvas de crecimiento se obtienen mediante el trazado de la número medio de células hijas producidas por una cepa determinada en función de la edad de punto. En este ejemplo, la cepa n º 2 es de mayor duración, pero es más lento crecimiento, como lo demuestra la reducción de la pendiente inicial de la parcela de crecimiento.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Reagent	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Bacto-Peptone	Reagent	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
Yeast Extract	Reagent	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)
Glucose