Medição Span vida replicativa na levedura de brotamento

Summary

Neste artigo apresentamos um protocolo geral para medir o tempo de vida replicativa das células-mãe do fermento.

Abstract

O envelhecimento é um processo degenerativo caracterizado por uma deterioração progressiva de componentes celulares e organelas, resultando em mortalidade. A levedura de brotamento

Protocol

Parte 1: Prepare cepas e placas para replicativa análise expectativa de vida

Esta seção descreve a preparação das placas sólido YEPD para uso no experimento período replicativo vida e da preparação de células de levedura para a análise de ciclo de vida.

1. Utilizando uma técnica estéril apropriado, preparar placas de ágar YEPD (extrato de levedura 1%, 2% Bacto-peptona, agar 2%, 2% de glicose) que será utilizada para células de levedura de cultura e para a análise replicativa vida. Você deve preparar, pelo menos, duas placas para cada 4-5 cepas a serem analisadas no experimento vida. As placas devem ser preparadas pelo menos 2 dias antes do experimento tempo de vida e deixa-se secar antes de iniciar o ensaio de vida. Se a experiência não será iniciado dentro de 4-5 dias de despejar as placas, eles devem ser colocados em uma incubadora refrigerada e envolto em parafilme ou plástico para evitar dessecação.
2. Remover cepas de leveduras das existências de congelados e raia para colônias única em ágar YEPD. Até 6 cepas podem ser facilmente riscado no mesmo prato YEPD dividindo a placa em tamanho igual torta em forma de cunhas.
3. Incubar as células a 30 ° C por 2 dias.
4. Remover as células da incubadora e células correção de uma única colônia em um prato doce YEPD. Duas manchas de duas diferentes colônias deve ser gerado para cada cepa. Neste momento, as cepas a serem analisadas devem ser codificadas para garantir a replicação experimento vida é feita "às cegas", onde o dissectors não sabe a identidade das cepas individuais.
5. Incubar o patch, as células codificadas a 30 ° C até a noite seguinte.
6. Remover as células e células de ânimo leve correção de cada linhagem codificada para novas placas YEPD, que servirá como as placas experimental utilizado para a análise período replicativo vida. As células devem ser corrigidos ao longo de uma linha vertical no lado esquerdo da placa de YEPD (Figura 1). Cerca de 3-5 amostras por placa é ótima, assumindo replicativa análise expectativa de vida em 20 células de cada patch. Não é necessário (nem desejável) para transferir um grande número de células para a placa de YEPD fresco, pois isso fará com que as células a crescer grossa durante a incubação overnight, o que pode limitar a sua vida útil subseqüente replicação.
7. Incubar as placas recém-corrigida durante a noite no topo do banco.

Parte 2: células de posição para análise replicativa vida.

Nesta seção descrevemos como posicionar as células de levedura na placa e como obter células-filhas virgens para análise replicativa vida. Deste ponto em diante, todas as placas devem ser parafilmed, exceto quando submetidos a dissecação, a fim de prevenir dessecação.

1. Usando um microscópio equipado com um aparelho de microdissecção adequado para levedura, a transferência de cerca de 50 células da cepa primeiro patch para uma posição na placa distal para as células corrigidas. Se o seu estágio do microscópio é graduado, essas gradações podem ser usados ​​para garantir as células serão fáceis de encontrar, durante as iterações subseqüentes. No Axioscope Zeiss 40, as células da cepa primeiro patch pode ser colocada nas coordenadas 90 x 10 e vestiu verticalmente a partir daí.
2. Limpe a agulha de células repetidamente tocando a superfície do ágar, em seguida, criar um buraco no agar, forçando a agulha através da superfície do ágar. Esse buraco vai servir como um marcador para orientá-lo sobre o prato durante as iterações subseqüentes de dissecção e remoção das células filha. Tenha cuidado para não obter células de levedura no buraco, ou eles vão crescer e formar uma colônia.
3. Diretamente acima do buraco, alinhar verticalmente células de levedura individuais em 20 posições uniformemente espaçadas, com diâmetros de agulhas 1-3 (~ 100 M) entre cada posição da célula (Figura 1). Cada poucas células, coloque duas células adjacentes uns aos outros na mesma posição na linha, em vez de um. Isto permite a redundância durante a virgem filha de seleção de célula, se uma das células transferidas não se divide.
4. Entre ^os dias 10 e 11 ^º posições na linha, criar uma série horizontal de 7-8 furos no agar. Isto irá servir como um marcador para orientá-lo sobre a placa durante as iterações subseqüentes de dissecção e remoção das células filha. Tenha cuidado para não obter células de levedura nos buracos, ou eles vão crescer e formar uma colônia.
5. Repita os passos de 2,1-2,4 para cada patch no prato, continuando a série de células verticalmente ao longo do mesmo eixo. Para o passo 2.2, o número de buracos criados deve corresponder ao número de patch (um furo para o primeiro patch, dois furos para o segundo, etc.)
6. Uma vez que as células já foram preparados para cada patch, parafilme a placa e incubar a 30 ° C por aproximadamente 2 horas.
7. Repita os passos de 2,1-2,6 para cada placa no experimento.

Obter células virgem filha para a análise de ciclo de vida: parte 3

Nesta seção, vamos iniciar a análise de ciclo de vida, assegurando que cada célula começa como uma virgem filhacélula.

1. Remova as placas da incubadora e verificar que a maioria das células dispostas foram submetidos a uma divisão celular. Se o tempo adicional é necessário para permitir a divisão celular para ser concluída, voltar a placa para a incubadora.
2. Começando com a primeira célula vestida, use a agulha para retirar células-filhas a partir da célula-mãe colocando delicadamente a agulha em cima das células em anexo. Às vezes é útil para explorar o lado da base do microscópio, enquanto a agulha está descansando sobre as células.
3. Coloque a célula-filha destacada na linha vertical, substituindo a célula-mãe e todas as células filhas adicionais e movê-los temporariamente de lado.
4. Repita o passo 3.2 e 3.3 para cada uma das células dispostas. Se uma célula não se divide, dê uma célula-filha de uma das células redundantes posicionado no passo 2.3. Quando terminar, você deve ter 20 células-filhas para cada patch alinhados verticalmente sobre a placa de vida.
5. Colete todas as células mãe e filha células extra em uma pilha e transferi-los de volta para uma área perto da patches ("cemitério"). É importante manter as células indesejadas longe de células em fase de análise expectativa de vida para prevenir a formação de microcolônias e esgotamento de nutrientes local.
6. Parafilm a placa e incubar a 30 ° C por aproximadamente 2 horas.
7. Repita os passos de 3,2-3,6 para cada placa no experimento.

Parte 4: Medição da capacidade de replicação das células individuais

1. Preparar os dados de vida folhas span. A vida útil folha de dados pode ser uma grade simples, onde cada linha corresponde a uma célula-mãe individual e cada coluna corresponde a uma idade-ponto (Figura 2). Etiqueta de cada folha de dados de acordo com o número de cepas a serem analisadas.
2. Remova as placas da incubadora e verificar que a maioria das células dispostas passaram por pelo menos uma divisão celular. Se o tempo adicional é necessário para permitir a divisão celular para ser concluída, voltar a placa para a incubadora.
3. Começando com a primeira célula formou na primeira placa, observar visualmente a célula mãe e filha (s) e determinar o número de divisões celulares que tenham ocorrido. Em geral, é fácil determinar quantas células-filhas de uma mãe produziu, com base em padrões característicos de arranjos celulares. Registrar o número de células filhas produzidas pela célula-mãe na caixa apropriada na súmula tempo de vida.
4. Use a agulha para retirar células-filhas a partir da célula-mãe, como descrito no passo 3.2.
5. Manter a célula-mãe na sua posição na vertical e mova a célula-filha (s) para temporariamente de lado.
6. Repita os passos de 4,3-4,5 para cada uma das células dispostas.
7. Coletar todas as células filhas descartados e movê-los para o 'cemitério', localizado próximo as manchas original.
8. Parafilm a placa e incubar a 30 ° C por 2-3 horas.
9. Repita os passos de 4,3-4,8 para cada placa no experimento.
10. Repita os passos até que todas as células 4,2-4,9 mãe pararam de se dividir. Como a idade células mãe, a progressão do ciclo celular se torna mais lenta e será desejável para incubar a placa por longos períodos de tempo entre a idade-points. As placas podem ser colocadas a 4 ° C durante a noite.

Parte 5: Resultados Representante.

Os dados brutos produzidos por um período de experiência de vida é um replicativa números lista correspondente às células produzidas por cada célula-mãe em cada idade-ponto (Figura 2). Somando-se cada linha da folha de pontuação, o tempo de vida replicativa para cada célula-mãe é obtido. Dados para células-mãe do mesmo grupo experimental podem ser agrupados para gerar uma curva de sobrevida (Figura 3A) e para realizar cálculos estatísticos, tais como expectativa de vida média, tempo de vida mediana e desvio padrão. Um teste não-paramétrico, como o teste de Wilcoxon Rank-Sum, pode ser realizada para determinar se diferenças significativas no tempo de vida foram detectados entre os grupos experimentais. Quando o experimento funciona corretamente, a curva de sobrevivência deve ser consistente com cerca de Gompertz-Makeham mostrando uma cinética sigmoidal shap com baixa mortalidade precoce seguido um declínio relativamente rápido na sobrevivência e um achatamento da curva de uma idade mais avançada. A maioria das linhagens selvagens têm valores replicativa tempo de vida na faixa de geração de 20-30, embora fora variação desta faixa tem sido relatada.

Figura 1. Diagrama de um típico prato período replicativo vida. À noite, antes de começar microdissecção de células de levedura, 3-5 cepas são levemente corrigido para a superfície de uma placa de YEPD (caixas vermelhas) em uma linha vertical ao longo de um lado da placa. Depois de um crescimento durante a noite, aproximadamente 30 células individuais de cada linhagem estão dispostas verticalmente em uma linha contendo 20 posições. Tempo de vida Analysis será realizada em células v virgem filha obtidos a partir dessas células iniciais. Células extra obtido a partir de microdissecção durante o experimento (por exemplo, células-filhas indesejadas) são colocados em "cemitério do" (oval cinza), que está localizado longe das células experimentais, a fim de evitar o esgotamento local de nutrientes como colônias são formadas.

Figura 2. A vida replicativa folha de registro span. Dados brutos de um experimento de tempo de vida replicativa é mostrado. Cada linha corresponde a uma única célula de levedura mãe e cada coluna corresponde a uma idade ponto. O número inserido em cada caixa é o número de células filhas produzidas por essa célula-mãe nessa idade ponto. Cada cepa é rotulado com um número codificado de tal forma que o indivíduo dissecar as células de levedura não tem conhecimento da identidade das cepas sendo analisado. Vinte células são analisadas para cada estirpe.

Figura 3. Sobrevivência representante e curvas de crescimento a partir de um experimento de tempo de vida replicativa. (A) As curvas de sobrevida são obtidos através da plotagem da fração de células mãe ainda está viva em função da idade replicativa (número de divisões celulares. (B) As curvas de crescimento são obtidos traçando a número médio de células-filhas produzidas por uma cepa dada em função da idade ponto. Neste exemplo, a tensão # 2 é de vida mais longa, mas é um crescimento mais lento, como evidenciado pela inclinação reduzida inicial da trama de crescimento.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Reagent	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Bacto-Peptone	Reagent	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
Yeast Extract	Reagent	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)
Glucose