Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

في التصوير Bioluminescent المجراة من أورام الثدي باستخدام IVIS الطيف

Published: April 29, 2009 doi: 10.3791/1210

Summary

يتم زرع الخلايا السرطانية الثديية معربا عن luciferase تحت الجلد في الفئران وتصور باستخدام التصوير الضوئي لمراقبة نمو الورم والتنمية غير جراحية في دراسة طولية.

Abstract

ويمكن زرع الخلايا السرطانية الثديية 4T1 الماوس الفرعي cutaneously في نيو / نو الفئران لتشكيل الأورام واضح في 15 إلى 20 يوما. هذا النموذج هو نظام الورم طعم أجنبي قيمة لمرحلة ما قبل السريرية المجراة في تقييم المركبات انتيتومور المفترضة.

وقد تم تصميم خط خلية 4T1 للتعبير عن constitutively الجين luciferase يراعة (luc2). عندما يتم حقن فئران تحمل 4T1 - luc2 الأورام مع Luciferin الأورام تبعث إشارة ضوئية البصرية التي يمكن رصدها باستخدام نظام التصوير الضوئي حساسة مثل الطيف IVIS. تدفق الفوتون من الورم يتناسب مع عدد الخلايا التي ينبعث منها ضوء ، ويمكن قياس الإشارات لمراقبة نمو الورم والتنمية. يتم معايرة IVIS لتمكين لا يمكن أن يؤديها الكميات المطلقة للإشارة bioluminescent والدراسات الطولية على مدى عدة أشهر وعلى مدى عدة أوامر من ضخامة إشارة دون المساس نتيجة الكمية.

ويمكن رصد نمو الورم لعدة أيام قبل بواسطة تلألؤ بيولوجي يصبح حجم الورم واضح أو قياسها بواسطة الوسائل المادية التقليدية. يمكن لهذا الرصد السريع توفر نظرة متعمقة في الأحداث في وقت مبكر من تطوير ورم أو تؤدي إلى إجراءات أقصر التجريبية.

يشار إلى موت الخلايا السرطانية ونخر بسبب نقص الأكسجين للعلاج أو دواء في وقت مبكر عن طريق تخفيض في إشارة bioluminescent. قد لا يكون هذا موت الخلايا يصاحبه انخفاض في حجم الورم مقاسا الوسائل المادية. القدرة على رؤية الأحداث في وقت مبكر من نخر الورم له تأثير كبير على اختيار وتطوير العوامل العلاجية.

التصوير الكمي لنمو الورم باستخدام IVIS يوفر الكميات الدقيقة ويسرع عملية تجريبية لتوليد النتائج.

Protocol

ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من luciferase معربا عن خطوط الخلايا السرطانية للبحوث ما قبل السريرية في نماذج الماوس.

وتقدم هذه الخلايا بوصفها ثقافة خالية من مسببات الأمراض المجمدة ، والتي سوف تنمو بسرعة في وسائل الاعلام القياسية مع عدم وجود حاجة لعلامات التحديد.

لتجربتنا ، سنستخدم 4T1 - luc2 الفئران الخلايا السرطانية الثديية الخط ، الذي يعبر عن هذا الجين luciferase يخدم كمؤشر البصرية في التعبير الجيني أو tumorgenesis في الجسم الحي. سوف نستخدم التعبير luciferase لتتبع نمو الورم الرئيسي غير جراحية ، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم لتحديد ورصد الآفات النقيلي.

يجب التحقق من النشاط Luciferase قبل الحقن ، ومن أجل القيام بذلك ، يتم حصادها قارورة 90 ٪ متموجة والتي trypsinization ثم تحصى.

ثم يتم الاستغناء عن 50000 الخلايا في بئر واحدة من لوحة microtiter والتخفيفات المتسلسلة يتم تنفيذها. يضاف إلى Luciferin آبار في 150ug لكل مل والمحتضنة لمدة 2 دقيقة. ولا يمكن تصوير وmicroplate في IVIS أو قارئ لوحة الانارة لتحديد مستويات التعبير. هذا الخط يعبر عن الخلية يصل إلى 6500 الفوتونات في كل خلية في الثانية الواحدة ، ولكن يمكن تصوير أي مستوى التعبير أعلاه 500 الفوتونات في كل خلية في الثانية بنجاح في الجسم الحي.

الآن أن لدينا خلايا النشاط الأمثل ، ويمكن أن ننتقل الى الخطوة الحقن تحت الجلد.

من أجل تسهيل الكشف الأمثل للورم ، ونحن باستخدام الماوس سلالة athymic المناعة عارية. قبل الحقن ، لتخدير الحيوانات هي أثر للتخدير عميق.

يتم حقن القادم فإننا سوف تضخ ما يصل إلى 250،000 الخلايا في برنامج تلفزيوني 100ul تحت الجلد في الجناح. تحميل الخلايا في حقنة 1 مل ونعلق إبرة قياس 26. رفع الجلد بلطف مع ملقط لجعل "خيمة" وحقن الخلايا في القاعدة. ولا يمكن تصوير حقن الخلايا حديثا على الفور. في كل دورة التصوير يدار ثم مجموعه من 150mg Luciferin لكل كيلوغرام من وزن الجسم عن طريق حقنتين في التجويف البريتوني.

في هذه الدراسة ، يتم تصوير الحيوانات بعد 10 دقائق من الحقن Luciferin لضمان تدفق ثابت الفوتون. سنوضح لك ذلك في الخطوة التالية. يمكن Luciferin حركية تختلف من يوم لآخر. في هذا نموذج معين ، وقياس 10 دقيقة بعد الحقن Luciferin أعطى نتيجة ضمن مجموعة من التقلبات 15 ٪.

لدينا تجربة سنستخدم الطيف IVIS في نظام التصوير فيفو يستخدم الخلفية ضعيفة الجهاز المسؤول إلى جانب تبريدها إلى -90 درجة مئوية إلى تحقيق أقصى قدر من الحساسية. لدعم الكميات المطلقة ، ونظام الإجراءات تهمة الظلام أثناء وقت لأسفل ويدير الذاتي المعايرة أثناء التهيئة. لبدء التصوير ، وتهيئة نظام IVIS (نقرة واحدة) ، وتعيين المعلمات التصوير للتجربة.

حدد مجال الرؤية بالنسبة لعدد الحيوانات التي يجري تصويرها. يمكن الحفاظ على ما يصل الى 5 في الحيوانات باستخدام أداة متعددة لا يتجزأ مخدر. المرحلة هو في 37 درجة مئوية ثابتة للحفاظ على درجة حرارة الجسم في الحيوانات. يتم توفير منفذ EKG لمراقبة صحة الحيوان خلال إجراءات مرهقة.

يمكن العيش في برامج الصور ، وقت التعرض ، و توقف بكسل ويكون الأمثل binning استنادا إلى مستوى التعبير عن خط الخلية. ويمكن تغيير هذه الإعدادات في أي وقت خلال تجربة دون التأثير على نتيجة الكمية.

IVIS يكتسب صورة فوتوغرافية للحيوان تحت الضوء الأبيض وإشارة أو الكمية bioluminescent فلوري ، وهو مضافين على الصورة.

وأعرب عن إشارة bioluminescent الفوتونات في الثانية الواحدة وعرضها باعتبارها خريطة كثافة. يتم ضبط عرض الصور لتوفير النقيض الأمثل والقرار في الصورة دون التأثير على الكميات.

ويمكن قياس التلألؤ من الخلايا في موقع الحقن باستخدام أداة المنطقة من الفائدة. يتم عرض بيانات القياس في الجدول جنبا إلى جنب مع كافة المعلمات التجريبية المتصلة التقاط الصور التي يمكن حفظها أو تصديرها للتحليل

يمكن الحصول على صور متعددة ، ومقارنة في الدراسات الطولية التي تغطي ثانية أو شهور تبعا لطبيعة التجربة. سوف نقوم بقياس تدفق الفوتون من الورم عند مستوى الصفر مرة ومراقبة لمدة 4 أسابيع مع التصوير في فترات كل أسبوعين.

تدفق الفوتون من الورم يتناسب مع عدد من الخلايا الحية لذلك معربا عن luciferase تلألؤ بيولوجي يرتبط مباشرة مع حجم الورم.

في آخر أيام 5 زرع الورم ليس واضح حتى الآن ولكن يمكن أن يكون كميا الخلايا من خلال تلألؤ بيولوجي ويعتبر الورم أن بنشاط متزايد. في هذه المرحلة هو إشارة تلألؤ بيولوجي stronge بكثيرر. ويمكن تعديل وقت التعرض ، و توقف وbinning بكسل بحيث تكون الصورة واضحة والكاميرا لا تشبع لا. IVIS يعوض تلقائيا عن التغييرات في جمع ضوء ذلك يمكن مقارنة هذه القياسات لتلك التي جمعت في وقت سابق وبعد ذلك في التجربة.

7 أيام في الأورام وزرع آخر واضح للمرة الأولى وتلألؤ بيولوجي القياس قد ولدت بالفعل 7 أيام من البيانات.

غرس في 28 يوما آخر ، والأورام أصبحت نخرية وتبدأ الخلايا في الموت. يقدر حجم الورم عن طريق قياس الفرجار لا يغير بشكل ملحوظ ، ولكن التألق من الورم سينخفض ​​مشيرا موت الخلية.

لا يمكن أن تستمر القياسات الفرجار وقياس تلألؤ بيولوجي حتى يتم التوصل إلى نقطة النهاية إنسانية. وسترد نخر الورم بسبب نقص الأكسجين أو الأنظمة العلاج تلألؤ بيولوجي خفضت حتى لو كانت لا تقلل من كتلة الورم.

Disclosures

وأود أن أؤكد أنه تم إجراء جميع التجارب أجريت لإنتاج مجلة المادة التجارب متصور في الامتثال للبروتوكول الحيوانية التي وافق عليها 060 رعاية الحيوان واستخدام اللجنة المؤسسية (IACUC) في علوم الحياة الفرجار ، ألاميدا CA كيم جاي ، فتاه دال ، IACUC الرئيس ، الفرجار العلوم الحياتية.

Tags

علم الأحياء الخلوي ، العدد 26 ، ورم الثدي ، والماوس ، تلألؤ بيولوجي ، في الجسم الحي ، والتصوير ، IVIS ، luciferase ، luciferin
<em>في</em> التصوير Bioluminescent <em>المجراة</em> من أورام الثدي باستخدام IVIS الطيف
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In More

Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum. J. Vis. Exp. (26), e1210, doi:10.3791/1210 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter