Summary
Mammaria cellule tumorali che esprimono luciferasi sono impiantato per via sottocutanea nei topi ed è visualizzato mediante imaging ottico per monitorare la crescita e lo sviluppo del tumore non invasivo in uno studio longitudinale.
Abstract
4T1 cellule del tumore mammario del topo può essere impiantato sottocute nel nu / nu topi di formare tumori palpabile in 15 a 20 giorni. Questo modello di xenotrapianto sistema tumore è prezioso per la pre-clinica nella valutazione in vivo di composti antitumorali putativo.
La linea di cellule 4T1 è stato progettato per esprimere costitutivamente il gene della luciferasi lucciola (luc2). Quando topi portatori 4T1-luc2 tumori sono iniettati con Luciferin i tumori emettono un segnale visivo luce che può essere controllata mediante un sistema di imaging ottico sensibile come la Spectrum IVIS. Il flusso di fotoni dal tumore è proporzionale al numero di celle che emettono luce e il segnale può essere misurato per controllare la crescita tumorale e lo sviluppo. IVIS è calibrato per consentire la quantificazione assoluta del segnale bioluminescente e gli studi longitudinali possono essere eseguite per molti mesi e su diversi ordini di grandezza del segnale senza compromettere il risultato quantitativo.
La crescita tumorale può essere monitorato per diversi giorni dalla bioluminescenza prima le dimensioni del tumore diventa palpabile e misurabile con i tradizionali mezzi fisici. Tale monitoraggio in grado di fornire una rapida panoramica eventi precoci nello sviluppo del tumore o portare a brevi procedure sperimentali.
Morte delle cellule tumorali e la necrosi a causa di un trattamento ipossia o farmaco è indicato all'inizio di una riduzione del segnale bioluminescente. Questa morte cellulare può non essere accompagnata da una riduzione delle dimensioni del tumore, misurato per mezzo fisico. La capacità di vedere eventi precoci nella necrosi tumorale ha un impatto significativo sulla selezione e lo sviluppo di agenti terapeutici.
L'imaging quantitativo della crescita tumorale mediante IVIS fornisce quantificazione precisa e accelera il processo sperimentale per generare i risultati.
Protocol
Una vasta gamma di linee di cellule tumorali che esprimono luciferasi può essere utilizzato per ricerca pre-clinica in modelli murini.
Queste cellule sono forniti come un esenti da organismi patogeni cultura congelata, che sarà facilmente crescere in mezzi di comunicazione standard senza necessità di marcatori di selezione.
Per il nostro esperimento, useremo il 4T1-luc2 murino linea di cellule tumorali mammarie, che esprime il gene della luciferasi, che funge da indicatore ottico di espressione genica o tumorgenesis in vivo. Useremo l'espressione luciferasi per monitorare la crescita del tumore primario non invasivo, ma possono anche essere utilizzato per individuare e monitorare le lesioni metastatiche.
Attività luciferasi deve essere verificata prima dell'iniezione, e per fare questo, un pallone al 90% confluenti viene raccolto da tripsinizzazione e poi contati.
50.000 cellule vengono poi dispensati in un singolo pozzo della micropiastra e diluizioni seriali vengono eseguite. Luciferina viene aggiunto ai pozzetti a 150ug per ml e incubate per 2 minuti. La micropiastra possono essere esposte in IVIS o un lettore di piastre luminescente per determinare i livelli di espressione. Questa linea cellulare esprime fino a 6500 fotoni al secondo per cella, ma ogni livello di espressione di sopra di 500 fotoni al secondo per ogni cella può essere ripreso con successo in vivo.
Ora che abbiamo le cellule di attività ottimale, si può procedere alla fase iniezione sottocutanea.
Al fine di facilitare l'individuazione ottimale del tumore, stiamo utilizzando un ceppo atimici immunocompromessi topo nudo. Prima dell'iniezione, gli animali sono anestetizzati per effetto di anestesia profonda.
Il prossimo iniettare fino a 250.000 cellule in PBS 100ul vengono iniettati per via sottocutanea nel fianco. Caricare le celle di una siringa da 1 ml e allegare a 26 gauge. Sollevare delicatamente la pelle con una pinza per fare una "tenda" e iniettare le cellule alla base. Le cellule nuovo apporto può essere ripreso immediatamente. In ogni sessione di imaging per un totale di 150 mg di Luciferin per kg di peso corporeo viene poi somministrato attraverso due iniezioni nella cavità peritoneale.
In questo studio, gli animali vengono esposte 10 minuti dopo l'iniezione Luciferin per garantire il flusso costante di fotoni. Vi mostreremo questo nella fase successiva. Cinetica luciferina può variare di giorno in giorno. In questo particolare modello, misura 10 minuti dopo l'iniezione Luciferin ha dato un risultato in un intervallo di variabilità del 15%.
Per il nostro esperimento useremo la spettro IVIS nel sistema di imaging in vivo utilizza un back-assottigliato Charge Coupled Device raffreddato a -90 ° C per ottenere la massima sensibilità. Per supportare la quantificazione assoluta, il sistema misura carica buio durante down-tempo e gestisce un auto-calibrazione durante l'inizializzazione. Per iniziare imaging, inizializzare il sistema IVIS (un click) e impostare i parametri di imaging per l'esperimento.
Selezionare il campo visivo per il numero di animali che sono ripreso. Fino a 5 animali possono essere tenuti nello strumento usando il collettore integrale anestetico. Il palcoscenico è alla temperatura costante di 37 ° C per mantenere la temperatura corporea negli animali. Una porta ECG è previsto per monitorare la salute degli animali durante le procedure di stress.
In Living software Image, tempo di esposizione, f-stop e pixel binning può essere ottimizzato in base al livello di espressione della linea cellulare. Queste impostazioni possono essere modificate in qualsiasi momento durante un esperimento senza impattare il risultato quantitativo.
IVIS acquisisce un'immagine fotografica dell'animale a luce bianca e un segnale quantitativo bioluminescente o fluorescenti, che si sovrappone l'immagine.
Il segnale bioluminescente è espressa in fotoni al secondo e visualizzato come una mappa di intensità. La visualizzazione dell'immagine viene regolata per fornire un contrasto ottimale e la risoluzione dell'immagine senza influire quantificazione.
Luminescenza dalle cellule può essere misurata nel sito di iniezione con una regione di strumento di interesse. Dati di misura sono visualizzati nella tabella con tutti i parametri sperimentali relativi alla cattura delle immagini che possono essere salvati o esportati per analisi
Più immagini possono essere acquisite e confrontati negli studi longitudinali relativi secondi o mesi a seconda della natura di questo esperimento. Noi misurerà il flusso di fotoni dal tumore al tempo zero e monitorare per 4 settimane con immagini a intervalli bi-settimanale.
Flusso di fotoni dal tumore è proporzionale al numero di cellule vive che esprimono in modo luciferasi bioluminescenza correla direttamente con le dimensioni del tumore.
A 5 giorni dopo l'impianto del tumore non è ancora palpabile, ma le cellule possono essere quantificati attraverso la bioluminescenza e il tumore è visto essere in fase di crescita. In questa fase il segnale di bioluminescenza è molto stronger. Il tempo di esposizione, f-stop e binning pixel può essere regolata in modo che l'immagine è chiara e la fotocamera non satura. IVIS compensa automaticamente i cambiamenti nella raccolta luce quindi queste misure possono essere confrontati con quelli raccolti in precedenza e in seguito all'esperimento.
A 7 giorni dopo l'impianto tumori sono palpabili per la prima volta e bioluminescenza misura ha già generato 7 giorni di dati.
A 28 giorni dopo l'impianto, i tumori stanno diventando necrotiche e le cellule cominciano a morire. Dimensioni del tumore stimato pinza misura non cambia sensibilmente, ma luminescenza dal tumore diminuisce indicare la morte cellulare.
Misure pinza e misurazione bioluminescenza può essere continuato fino a quando un endpoint umano è raggiunto. Necrosi tumorale a causa di regimi di ipossia o trattamento sarà indicata da bioluminescenza ridotto anche se non ridurre la massa tumorale.
Disclosures
Vorrei assicurare che tutti gli esperimenti effettuati per produrre la Gazzetta di Visualizzato articolo esperimenti sono stati condotti nel rispetto del protocollo Animal 060 approvato dalla cura degli animali e utilizzo Comitato Istituzionale (IACUC) a pinza Life Sciences, Alameda CA Jae Kim, Ph . D., presidente IACUC, Caliper Life Sciences.
