In vivo Biolumineszenz Imaging von Brusttumoren mit IVIS Spectrum

Summary

Brusttumor-Zellen, die Luciferase werden subkutan in Mäuse implantiert und visualisiert mit Hilfe der optischen Bildgebung, das Tumorwachstum und die Entwicklung nicht-invasiv in einer Längsschnittstudie zu überwachen.

Abstract

4T1 Maus Mamma Tumorzellen subkutan in nu / nu-Mäusen implantiert werden, um tastbare Tumoren in 15 bis 20 Tage bilden. Diese Xenograft-Tumor-Modell ist für die präklinische in vivo Evaluierung von mutmaßlichen Antitumorverbindungen wertvoll.

Die 4T1-Zelllinie wurde entwickelt, um konstitutiv die Glühwürmchen-Luciferase-Gen (luc2). Wenn Mäuse mit 4T1-luc2 Tumoren sind mit Luciferin die Tumoren strahlen eine visuelle Lichtsignal, überwacht mit Hilfe eines empfindlichen optischen Imaging-System wie die IVIS Spectrum kann injiziert. Der Photonenfluss aus dem Tumor ist proportional zur Anzahl der lichtemittierenden Zellen und das Signal kann gemessen werden, um das Tumorwachstum und die Entwicklung zu überwachen. IVIS kalibriert ist, damit absolute Quantifizierung der Biolumineszenz-Signal und Längsschnittstudien über viele Monate und über mehrere Aufträge von Signalgröße kann, ohne dabei das quantitative Ergebnis durchgeführt werden.

Das Tumorwachstum kann für mehrere Tage durch Biolumineszenz beobachtet werden, bevor die Tumorgröße wird spürbar oder messbar traditionellen physikalischen Mitteln. Diese schnelle Überwachung kann Einblick in frühe Ereignisse in der Tumor-Entwicklung bereitzustellen oder führen zu kürzeren experimentellen Verfahren.

Tumor Zelltod und Nekrose durch Hypoxie oder medikamentöse Behandlung ist eine frühzeitige durch eine Reduktion der Biolumineszenz-Signal angezeigt. Das Zelltod möglicherweise nicht durch eine Reduktion der Tumorgröße von materiellen Mitteln gemessen begleitet werden. Die Fähigkeit zur frühen Ereignisse in Tumor-Nekrose-sehen hat erhebliche Auswirkungen auf die Auswahl und Entwicklung von Therapeutika.

Quantitative Bildgebung des Tumorwachstums mit IVIS bietet eine präzise Quantifizierung und beschleunigt den experimentellen Prozess, um Ergebnisse zu erzielen.

Protocol

Eine Vielzahl von Luciferase exprimierenden Zelllinien können für die präklinische Forschung in Maus-Modellen verwendet werden.

Diese Zellen werden als pathogen-freien gefrorenen Kultur, die sich leicht in Standard-Medien wachsen, ohne dass für Selektionsmarker zur Verfügung gestellt.

Für unser Experiment verwenden wir die 4T1-luc2 murine Brusttumor-Zelllinie, die das Luciferase-Gen, das als eine optische Anzeige der Genexpression oder Tumorgenese in vivo dient zum Ausdruck bringt. Wir verwenden Luciferaseexpression zum Wachstum des Primärtumors nicht-invasiv Spur, aber sie können auch verwendet werden, zu lokalisieren und zu überwachen metastatischen Läsionen werden.

Luciferaseaktivität überprüft werden müssen vor der Injektion, und um dies tun zu können, ist eine 90% konfluent Kolben durch Trypsinierung geerntet und dann gezählt.

50.000 Zellen werden dann in einer einzigen Vertiefung einer Mikrotiterplatte und Verdünnungsreihen verzichtet werden durchgeführt. Luciferin wird in die Vertiefungen an 150ug pro ml zugegeben und für 2 Minuten. Die Mikrotiterplatte kann in IVIS oder einer lumineszierenden Platte Leser Expression bestimmen abgebildet werden. Diese Zellinie exprimiert bis 6500 Photonen pro Sekunde pro Zelle, aber jeder Ausdruck Ebene oberhalb von 500 Photonen pro Sekunde pro Zelle können erfolgreich in vivo dargestellt werden.

Jetzt, da wir Zellen optimale Aktivität haben, können wir auf die subkutane Injektion Schritt fort.

Um eine optimale Erkennung des Tumors zu erleichtern, werden wir die Verwendung eines athymischen immungeschwächten Nacktmaus Belastung. Vor der Injektion werden die Tiere betäubt, um für tiefe Betäubung Wirkung.

Als nächstes werden wir spritzen bis zu 250.000 Zellen in 100 ul PBS subkutan in die Flanke injiziert. Laden Sie die Zellen in einer 1 ml Spritze eine 26 Gauge Nadel. Heben Sie die Haut vorsichtig mit einer Pinzette ein "Zelt" zu machen und injizieren die Zellen an der Basis. Die neu injizierten Zellen können sofort abgebildet werden. In jedem Imaging-Sitzung insgesamt 150 mg Luciferin pro kg Körpergewicht wird dann über zwei Injektionen in die Bauchhöhle verabreicht.

In dieser Studie werden die Tiere 10 Minuten nach Injektion Luciferin abgebildet, um konsistente Photonenfluss zu gewährleisten. Wir zeigen Ihnen, diese im nächsten Schritt. Luciferin Kinetik von Tag zu Tag variieren. In diesem Modell, Messung 10 Minuten nach Injektion Luciferin gab ein Ergebnis innerhalb eines Bereiches von 15% Variabilität.

Für unser Experiment werden wir die IVIS Spectrum in vivo Imaging-System verwenden wird ein Back-ausgedünnt charge coupled device gekühlt auf -90 ° C bis maximale Empfindlichkeit zu erreichen. Zur Unterstützung der absolute Quantifizierung, misst das System dunklen Ladung während down-Zeit und führt eine Selbstkalibrierung während der Initialisierung. So starten Bildgebung, initialisieren Sie die IVIS System (ein Klick) und stellen Sie die Imaging-Parameter für das Experiment.

Wählen Sichtfeld für die Anzahl der Tiere abgebildet. Bis zu 5 Tiere können in das Gerät mit dem integrierten Anästhesie vielfältig gepflegt werden. Die Bühne ist mit einer konstanten 37 ° C auf Körpertemperatur der Tiere aufrecht zu erhalten. Ein EKG-Anschluss ist vorgesehen, um die Tiergesundheit in stressigen Verfahren zu überwachen.

In Living Image Software, Belichtungszeit, Blende und Pixel-Binning können basierend auf der Expression der Zelllinie optimiert werden. Diese Einstellungen können jederzeit während eines Experiments werden ohne Auswirkungen auf das quantitative Ergebnis verändert.

IVIS erwirbt ein fotografisches Bild des Tieres unter weißem Licht und einer quantitativen Biolumineszenz oder Fluoreszenz-Signal, das auf dem Bild überlagert ist.

Die Biolumineszenz-Signal wird in Photonen pro Sekunde und als einer Intensität Karte. Die Bildanzeige wird angepasst, um optimale Kontrast und Auflösung des Bildes, ohne die Quantifizierung bieten.

Lumineszenz aus den Zellen können an der Injektionsstelle mit einem region of interest-Tool gemessen werden. Die Messdaten werden in der Tabelle zusammen mit allen experimentellen Parameter im Zusammenhang mit der Aufnahme von Bildern, die gespeichert oder exportiert werden kann für die Analyse angezeigt

Mehrere Bilder können erworben werden und im Vergleich in Längsschnittstudien für Sekunden oder Monaten, je nach der Art des Experiments. Wir werden Photonenfluss aus dem Tumor zu messen zum Zeitpunkt Null und Monitor für 4 Wochen mit Bildgebung bei bi-wöchentlichen Abständen.

Photonenfluss aus dem Tumor ist proportional zur Anzahl der lebenden Zellen, die Luciferase so Biolumineszenz korreliert direkt mit der Tumorgröße.

Bei 5 Tage nach der Implantation des Tumors ist noch nicht greifbar, aber die Zellen können durch Biolumineszenz und der Tumor gesehen werden aktiv wachsenden quantifiziert werden. In diesem Stadium der Biolumineszenz-Signal ist viel stronger. Die Belichtungszeit, Blende und Pixel-Binning kann so eingestellt, dass das Bild klar ist und die Kamera nicht zu sättigen. IVIS kompensiert automatisch die Änderungen im Lichte Sammlung, so dass diese Messungen mit denen früher und später im Experiment gesammelten verglichen werden kann.

An 7 Tagen nach der Implantation Tumoren sind spürbar zum ersten Mal und Biolumineszenz-Messung bereits 7 Tage der Daten erzeugt hat.

Nach 28 Tagen nach der Implantation, sind Tumoren es nekrotisch und Zellen beginnen zu sterben. Tumorgröße durch Dickenmessung geschätzt nicht merklich verändert, aber Lumineszenz aus dem Tumor verringert Angabe Zelltod.

Caliper Messungen und Biolumineszenz-Messung kann fortgesetzt werden, bis eine humane Endpunkt erreicht ist. Tumor-Nekrose durch Hypoxie oder Behandlungen wird durch reduzierte Biolumineszenz angegeben werden, auch wenn sie reduzieren nicht die Tumormasse.