Summary
Молочные опухоль клеток, экспрессирующих люциферазы имплантируются под кожу мышей и визуализированы с использованием оптических изображений для контроля опухолевого роста и развития неинвазивно в продольном исследовании.
Abstract
4T1 молочной железы мыши клетки опухоли могут быть имплантированы подкожно в ню / ню мышей форме ощутимой опухоли у 15 до 20 дней. Это ксенотрансплантата модели системы опухоли является ценным для доклинических в естественных условиях оценка предполагаемых соединений противоопухолевого.
4T1 клеточной линии был спроектирован, чтобы выразить конститутивно ген люциферазы светлячка (luc2). Когда мышей, несущих 4T1-luc2 опухоли вводили люциферин опухоли выделяют визуальный сигнал света, который можно контролировать с помощью чувствительной оптической системой визуализации, как Спектр ИВИС. Поток фотонов от опухоли прямо пропорционально числу светлых клеток и излучающих сигнал может быть измерен для контроля опухолевого роста и развития. ИВИС откалиброван чтобы абсолютное количественное биолюминесцентного сигнала и продольные исследования могут быть выполнены в течение многих месяцев и старше на несколько порядков величины сигнала без снижения количественного результата.
Рост опухоли можно наблюдать в течение нескольких дней по биолюминесценции, прежде чем размер опухоли становится ощутимым или измеримым традиционными физическими средствами. Этот быстрый мониторинг может дать представление о ранних событиях в развитие опухоли или привести к более коротким экспериментальных процедур.
Опухоль гибель клеток и некроз в результате лечения гипоксии или Препарат назначают досрочно сокращение биолюминесцентного сигнала. Это гибель клеток может не сопровождаться уменьшение размера опухоли, как измеряется физическими средствами. Способность видеть события в ранней некроза опухоли оказывает существенное влияние на выбор и разработку терапевтических средств.
Количественная визуализация опухолевого роста использования ИВИС обеспечивает точный количественный и ускоряет экспериментальный процесс для получения результатов.
Protocol
Широкий спектр люциферазы выражения линий раковых клеток может быть использован для доклинических исследованиях на мышах.
Эти клетки предоставляются в качестве патогенов без замороженных культуры, которая будет легко расти в стандартных средствах массовой информации без необходимости выбора маркеров.
Для нашего эксперимента, мы будем использовать 4T1-luc2 мышиной молочной линии клеток опухоли, которая выражает гена люциферазы, которая служит оптический индикатор экспрессии генов или tumorgenesis в естественных условиях. Мы будем использовать выражение люциферазы отслеживать рост первичной опухоли неинвазивным, но они также могут быть использованы для обнаружения и мониторинга метастатического поражения.
Люциферазы деятельность должна быть проверена перед инъекцией, и для того, чтобы сделать это, 90% сливной колбу собирают трипсинизации а затем подсчитываются.
50000 клетки затем распределены в одну лунку планшет и серийные разведения выполняются. Люциферин добавляется скважин на 150ug на мл и инкубировали в течение 2 минут. Планшет может быть отображены в ИВИС или люминесцентные читателя пластины для определения уровня экспрессии. Эта клеточная линия выражает до 6500 фотонов в секунду на камеру, но любое выражение уровня выше 500 фотонов в секунду на ячейку может быть успешно отображаемого в естественных условиях.
Теперь у нас есть клетки оптимальной деятельности, мы можем перейти к шагу подкожной инъекции.
В целях содействия оптимального обнаружения опухоли, мы используем athymic иммунитетом обнаженной штамм мыши. До инъекции, животных под наркозом, чтобы эффект для глубокой анестезии.
Далее мы будет вводить до 250000 клеток в 100 мкл PBS вводят подкожно в бок. Нагрузка клеток в 1 мл шприц и присоедините 26 иглы. Поднимите кожи осторожно пинцетом, чтобы сделать "палатка" и ввести клетки у основания. Вновь вводили клетки могут быть отображены немедленно. В каждом из изображений сессии в общей сложности 150 мг люциферина на кг массы тела затем вводят через две инъекции в брюшную полость.
В этом исследовании, животные изображаются через 10 минут после инъекции люциферин для обеспечения последовательного потока фотонов. Мы покажем вам это в следующем шаге. Люциферин кинетики может меняться изо дня в день. В данной модели, размером 10 минут после инъекции люциферин дал результат в диапазоне от 15% изменчивости.
Для нашего эксперимента мы будем использовать ИВИС спектра в системе естественных изображений использует резервные разбавленной с зарядовой связью устройство охлаждается до -90 ° С до достижения максимальной чувствительности. Для поддержки абсолютного количественного, система мер темно заряд в течение времени простоя и работает самокалибровка во время инициализации. Для начала обработки изображений, инициализации системы ИВИС (один клик) и установить параметры изображения для эксперимента.
Выберите поле зрения числа перевозимых животных, образ. До 5 животные могут быть сохранены в приборе с использованием интегрального анестезии многообразия. Этапе при постоянной температуре 37 ° С для поддержания температуры тела у животных. ЭКГ порта обеспечивается для контроля здоровья животных во время стрессовых процедур.
В живой образ программного обеспечения, время экспозиции, диафрагмы и пиксельные биннинга может быть оптимизирован на основе уровня экспрессии клеточной линии. Эти параметры могут быть изменены в любое время в течение эксперимента, не влияя на количественный результат.
ИВИС приобретает фотографическое изображение животного под белым светом и количественные биолюминесцентного или флуоресцентный сигнал, который накладывается на изображение.
Биолюминесцентного сигнала выражается в фотонов в секунду и отображается в виде интенсивности карте. Изображение дисплея регулируется, чтобы обеспечить оптимальную контрастность и разрешение в изображении, не затрагивая количественного определения.
Люминесценция из клеток могут быть измерены на месте инъекции использованием область интереса инструмент. Данные измерений отображаются в таблице вместе со всеми экспериментальные параметры, касающиеся захвата изображения, которые могут быть сохранены или экспортированы для анализа
Множественные изображения могут быть получены и сопоставлены в продольных исследований, охватывающих секунд или месяцев в зависимости от характера эксперимента. Мы будем измерять поток фотонов от опухоли в нулевой момент времени и контролировать в течение 4 недель с изображениями на двух-недельным интервалом.
Поток фотонов от опухоли прямо пропорционально количеству живых клеток, экспрессирующих люциферазы так биолюминесценции в прямой зависимости размера опухоли.
В 5 дней после имплантации опухоли еще не ощутима, но клетки могут быть количественно через биолюминесценции и опухоль видна активно растет. На данном этапе биолюминесценции сигнала значительно strongeг. Время экспозиции, диафрагмы и пиксельные биннинга можно отрегулировать так, что изображение четкое и камера не насыщает. ИВИС автоматически компенсирует изменения в свет коллекция поэтому эти измерения могут быть по сравнению с теми, собранные ранее, а затем в эксперименте.
На 7 дней после имплантации опухоли являются ощутимыми в первый раз, и измерение биолюминесценции уже сформирован 7 дней данных.
На 28 дней после имплантации, опухоли становятся некротических и клетки начинают отмирать. Размер опухоли оценивается суппорт измерения не изменяется заметно, но свечение от опухоли снизится указывает гибели клеток.
Суппорт измерений и биолюминесценции измерения может быть продолжен до гуманного конечная точка достигнута. Некроза опухоли из-за гипоксии или режимов лечения будет обозначено снижение биолюминесценции, даже если они не уменьшают опухоли.
Disclosures
Я хотел бы заверить, что все эксперименты по производству Журнал Визуализированные статье Эксперименты проводились в соответствии с протоколом 060 животных утвержденным Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) на суппорт наук о жизни, Alameda CA Джей Ким, Ph . Д., IACUC председатель суппорт наук о жизни.
