In vivo Bioluminescent Imaging för juvertumörer Använda IVIS Spectrum

Summary

Bröst tumörceller som uttrycker luciferas implanteras subkutant till möss och visualiseras med hjälp av optisk avbildning för att övervaka tumörtillväxt och utveckling icke-invasivt i en longitudinell studie.

Abstract

4T1 mus bröst tumörceller kan inplanteras sub-kutant i nu / nu möss att bilda påtaglig tumörer i 15 till 20 dagar. Denna xenograft tumör modellsystem är värdefull för den prekliniska in vivo utvärdering av förmodade Antitumor föreningar.

Den 4T1 cellinje har utvecklats för att konstitutivt uttryck för Firefly luciferas gen (luc2). När möss bär 4T1-luc2 tumörer injiceras med luciferin tumörerna avger en visuell ljussignal som kan övervakas med hjälp av en känslig optisk avbildning system som det IVIS Spectrum. Fotonen flux från tumören är proportionell mot antalet ljusemitterande celler och signalen kan mätas för att kontrollera tumörens tillväxt och utveckling. IVIS är kalibrerad för att absolut kvantifiering av den självlysande signalen och longitudinella studier kan utföras under många månader och under flera order av signal storleksordning utan att kompromissa med kvantitativa resultat.

Tumörtillväxt kan övervakas under flera dagar av mareld innan tumörens storlek blir påtaglig eller mätbara med traditionella fysiska medel. Denna snabba övervakning kan ge insikt i början händelser i tumörutveckling eller leda till kortare experimentella procedurer.

Tumör celldöd och nekros på grund av hypoxi eller läkemedelsbehandling är indicerad tidigt av en minskning av den självlysande signalen. Denna celldöd kanske inte åtföljas av en minskning av tumörens storlek mätt med fysiska medel. Förmågan att se tidiga händelser i tumörnekros har betydande inverkan på urval och utveckling av behandlingsmetoder.

Kvantitativa avbildning av tumörtillväxt med IVIS ger exakt kvantifiering och påskyndar den experimentella processen för att generera resultat.

Protocol

Ett brett utbud av luciferas uttrycka cancercellinjer kan användas för preklinisk forskning i musmodeller.

Dessa celler finns som en patogenfria frysta kultur, som lätt kommer att växa i vanliga media med något behov av markörerna.

För våra experiment använder vi 4T1-luc2 murin bröst linje tumörceller som uttrycker luciferas genen som fungerar som en optisk indikator på genuttryck eller tumorgenesis in vivo. Vi kommer att använda luciferas uttryck för att spåra tillväxten av den primära tumören icke-invasivt, men de kan också användas för att lokalisera och övervaka metastaser.

Luciferas aktiviteten måste kontrolleras före injektion och för att göra detta är en 90% konfluenta kolv skördas trypsinization och sedan räknas.

50 tusen celler slänger i en enda brunn i en mikrotiterplatta och spädningar utförs. Luciferin läggs till brunnarna 150ug per ml och inkuberas i 2 minuter. Mikroplattan kan avbildas i IVIS eller en självlysande platta läsaren att avgöra uttryck nivåer. Denna cellinje uttrycker upp till 6500 fotoner per sekund per cell, men alla uttryck nivå över 500 fotoner per sekund per cell kan avbildas framgångsrikt in vivo.

Nu när vi har celler optimal aktivitet, kan vi gå vidare till subkutan injektion steg.

För att underlätta optimal upptäckt av tumören använder vi en athymic nedsatt immunförsvar nakna musstam. Före injektion, djuren bedövas med effekt för djup anestesi.

Nästa vi kommer att injicera upp till 250.000 celler i 100ul PBS injiceras subkutant i flanken. Ladda celler i en 1 ml spruta och bifoga en 26 gauge nål. Lyft huden försiktigt med pincett för att göra ett "tält" och injicera celler vid basen. Den nyligen injicerade cellerna kan avbildas direkt. I varje avbildning session totalt 150 mg av luciferin per kg kroppsvikt är sedan administreras via två injektioner i bukhålan.

I denna studie är djur avbildas 10 minuter efter luciferin injektion för att säkerställa konsekvent fotonen flux. Vi visar dig detta i nästa steg. Luciferin kinetik kan variera från dag till dag. I denna modell, som mäter 10 minuter efter luciferin injektionen gav ett resultat inom intervallet 15% variabilitet.

För vårt experiment vi använder IVIS Spectrum in vivo imaging system använder en back-förtunnas Charge Coupled Device kyls ned till -90 ° C för att uppnå maximal känslighet. För att stödja absolut kvantifiering, mäter systemet mörka laddning under stillestånd och driver en självkalibrering under initieringen. För att starta bildbehandling, initiera IVIS systemet (ett klick) och ställ in bildhantering parametrar för experimentet.

Välj synfältet för det antal djur som avbildas. Upp till 5 djur kan hållas i instrumentet med hjälp av den integrerade narkos grenröret. Scenen är på en konstant 37 ° C för att upprätthålla kroppstemperaturen hos djur. En EKG-port finns för att övervaka djurens hälsa under stressande rutiner.

I Living bildbehandlingsprogram, exponeringstid, bländare och Pixel binning kan optimeras utifrån uttryck nivå cellinje. Dessa inställningar kan ändras när som helst under ett experiment utan att påverka den kvantitativa resultatet.

IVIS förvärvar en fotografisk bild av djuret under vitt ljus och en kvantitativ självlysande eller fluorescerande signal som överlagras på bilden.

Den självlysande signalen uttrycks i fotoner per sekund och visas som en intensitet karta. Bilden visas justeras för att ge optimal kontrast och upplösning i bilden utan att påverka kvantifiering.

Luminiscens från cellerna kan mätas vid injektionsstället med en region av intresse verktyg. Mätdata visas i tabellen tillsammans med alla experimentella parametrar som rör Bildinsamling som kan sparas eller exporteras för analys

Flera bilder kan fås och jämföras i longitudinella studier som täcker sekunder eller månader beroende på vilken typ av experiment. Vi kommer att mäta foton flux från tumören vid tidpunkten noll och övervaka i 4 veckor med bildhantering på varannan vecka.

Photon flux från tumören är proportionell mot antalet levande celler som uttrycker luciferas så mareld korrelerar direkt med tumörstorlek.

Vid 5 dagar efter implantation tumören är ännu inte påtaglig men cellerna kan kvantifieras genom mareld och tumören ses att aktivt växer. I detta skede mareld signalen stronge mycketr. Exponeringstid, bländare och Pixel binning kan justeras så att bilden är tydlig och kameran inte mättad. IVIS kompenserar automatiskt för de förändringar i ljus samling så dessa mätningar kan jämföras med de tidigare insamlade och senare i experimentet.

Vid 7 dagar efter implantation tumörer är påtaglig för första gången och mareld mätning har redan genererat 7 dagar av data.

På 28 dagar efter implantation, är tumörer blir nekrotisk och cellerna börjar dö. Tumörstorlek uppskattats av bromsok mätning ändras inte nämnvärt, men luminiscens från tumören minskar indikerar celldöd.

Bromsok mätningar och mareld mätning kan fortsätta tills en human slutpunkt nås. Tumörnekros grund av hypoxi och behandlingsmetoder kommer att anges av minskad mareld även om de inte minskar tumören massa.