Summary
Внутреннее ухо чувствительного эпителия взрослых данио является хорошей модельной системой для понимания механизмов волосы регенерации клеток у взрослых позвоночных. Этот протокол демонстрирует прекрасный рассечение эпителия, через который мы можем получить образцы тканей для изучения регенеративных событий на клеточном и субклеточном уровнях.
Abstract
Нейросенсорная эпителия внутреннего уха являются ключевой структуры для слуха и равновесия функций. Таким образом, важно понимать, клеточном и молекулярном особенности эпителия, которые в основном состоят из двух типов клеток: волосковых клеток (УВ) и опорных клеток (ПК). Здесь мы выбираем для изучения внутреннего уха сенсорно эпителии у взрослых данио не только потому, эпителиальных структур хорошо сохранились и у всех позвоночных изучены, но и потому, что взрослые данио способен к регенерации УВ, возможность, что млекопитающие теряют вскоре после рождения. Мы используем внутреннего уха взрослых данио в качестве модельной системы для изучения механизмов внутреннего уха HC регенерации у взрослых позвоночных животных, которые могли бы быть полезными для клинической терапии слуха / баланс дефицита в человеческом, в результате потери HC.
Здесь мы показываем, как это сделать общей и мелкой вскрытия внутреннего уха сенсорно эпителия у взрослых рыбок данио. Валовой рассечение удаляет тканей, окружающих внутреннее ухо и полезно для подготовки срезов ткани, что позволяет нам изучить детальную структуру сенсорного эпителия. Штрафа рассечение очищает не-сенсорно-эпителиальные ткани каждого отдельного эпителия и позволяет рассматривать неоднородность целом эпителий легко в целом монтажа эпителиальных образцов.
Protocol
Часть 1: Подготовка ткани
- Эвтаназии взрослых данио с буфером MS-222 (3-этил аминобензоат метансульфонат соли, 0,03%).
- Обезглавьте рыбы. Отрежьте нижнюю челюсть, место голову на вскрытии пластины с вентральной стороной вверх, и иммобилизации ткани насекомых булавками. Удаление мягких тканей брюшной части черепа и трещины открыты вентральной части черепа капсула с парой тонких пинцета под рассечение микроскопом.
- Fix рыбы голову в параформальдегида (4%) при температуре 4 ° С в течение ночи.
- Промыть фиксированной голове рыбы в PBS (фосфатно-солевым буфером, 1X) в течение 3 раза, 5 минут каждый раз.
Часть 2: Валовой рассечение внутреннего уха
- Место рыбы голову на вскрытии пластины с вентральной стороной вверх. Остановите его с насекомыми булавки. Все следующие шаги осуществляются по рассечение микроскопом.
- С парой тонких пинцет, удалите кости черепа над внутреннего уха и затем осторожно вытащить внутренние ткани уха: мешочки, lagenae и utricles. Мешочек и лагены плотно приложить друг к другу и, таким образом вытащить вместе, маточки (впереди мешочек и лагены), будет, скорее всего, быть отделена от других органов конца во время вскрытия.
- Положите внутренние ткани уха в PBS (1X). Если никаких дальнейших штраф вскрытия необходимо, промойте ткань 2-3 раза с PBS (1X) и может быть использован для других экспериментах, например cryosections.
Часть 3: Fine рассечение внутреннего уха сенсорно эпителия
- Штрафа рассечение может быть проведено в капле PBS (1X) на чистую предметное стекло.
- Удалить утрикулярных отолитовой от маточки с двумя парами штраф пинцет, и, при необходимости, обрезать без сенсорного эпителиальных тканей и иннервации из эпителия с парой тонких пинцет и иглу лезвия.
- Удалить лагенарной отолитовой перед отделением саккулярной и лагенарной эпителия в то время как попытаться сохранить весь мешочек, как нетронутыми, насколько возможно. Место ткани в раскрывающемся PBS с вентральной стороной вверх. Используйте иглу лезвие аккуратно надрезать между мешочек и лагены. Аккуратный от чрезмерного без сенсорного эпителиальной ткани и innvervation с мелкими пинцет и иглу лезвие, если это необходимо.
Часть 4: Флуоресцентный окрашивание волос клеток в эпителии сенсорные
- Промыть сенсорных эпителия с PBT (1XPBS и 1% Тритон Х-100) 3 раза, 5 мин каждый раз.
- Инкубируйте эпителия с fluophore меченных фаллоидином (например, Alexa Мука 488 фаллоидином, 1:1000 разбавления) в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Промыть сенсорных эпителия с PBT 3 раза, 10 мин каждый раз.
- Горы эпителия на слайд с монтажными средних и проверить окрашенные ткани под флуоресцентный микроскоп с фильтрами надлежащей длины волны.
- После успешного вскрытия и окрашивания, нетронутыми эпителия с сильными окрашивания ячейки пучок волос можно увидеть под микроскопом (рис. 1).
Рисунок 1. Волосы клетки саккулярной сенсорного эпителия окрашивали Alexa Мука 488 фаллоидином (зеленый). Образец ткани была расчленена и окрашенных как указано в статье. Некоторые снимки были сделаны при разных положениях образца и черепичные вместе с Adobe Photoshop 7.0.
Шкала бар = 150 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе, мы описали общей и мелкой рассечение внутреннего уха сенсорно эпителия взрослых данио, которая позволяет нам подготовить образец ткани для изучения клеточных и субклеточных особенностей сенсорного эпителия.
Для того, чтобы осуществлять успешное вскрытие, самый первый шаг, фиксация, это очень важно. Убедитесь, что вы всегда использовать свежеприготовленный параформальдегида решение, потому что старое решение приведет в возрасте до фиксации тканей, которые трудно управлять во время вскрытия. Однако, убедитесь, что вы не за-фиксировать ткани, оставляя их в фиксации решения слишком долго, потому что это будет мешать результатов иммунного / гистологического окрашивания после вскрытия. Кроме того, используя ухоженные рассечение инструментов, которые находятся в соответствующих размеров имеет решающее значение, а, особенно для тонкой рассечение.
Такая грубая протокол вскрытия также может быть приспособлен для приобретения внутренние ткани уха для добычи тканеспецифические ДНК / РНК / белков. В этом случае, вскрытие должно проводиться сразу после жертву рыбы без параформальдегида фиксации. Кроме того, некоторые методы процедура может быть использована для защиты деградации целевой макромолекул. Например, рыбья голова (нижняя челюсть удалена) можно промыть и затем погружали в раствор RNAlater (Амбион) во время вскрытия для тканеспецифические добычи РНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Внутренние программы исследований Национальной геноме человека Научно-исследовательского института, Национального института здоровья.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Reagent | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| PBS (Phosphate-buffered Saline, 10X) | Reagent | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Reagent | Invitrogen | A12379 | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | Reagent | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Dissection microscope | Microscope | Nikon Instruments | SMZ1000 | |
| Insect pins | Tool | Fine Science Tools | 26000-40 | |
| Scissors | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
| Tweezers | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045 | |
| Needle blade | Tool | Sharpoint | 78-6810 | |
| Fluorescent microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 200M | |
| Dissection pad | Tool | eNasco | SB07840M | |
| Zebrafish | Animal | Various | n/a |
