Summary
ظهارة الأذن الداخلية الحسية من الزرد هو نظام أخلاقي نموذجا جيدا لفهم آليات تجديد خلايا الشعر في الفقاريات الكبار. هذا البروتوكول يوضح تشريح غرامة من ظهائر ، التي نستطيع من خلالها الحصول على عينات الأنسجة لدراسة الأحداث على المستويات التجدد الخلوي والتحت خلوية.
Abstract
ظهائر العصبي الحسي في الأذن الداخلية هي حاسمة بالنسبة لهياكل وظائف السمع والتوازن. لذا ، فمن المهم أن نفهم ملامح الخلوية والجزيئية للظهائر ، والتي تتكون أساسا من نوعين من الخلايا : خلايا الشعر (الهيدروجيني) والخلايا المساندة (SCS). هنا نختار لدراسة ظهائر الأذن الداخلية الحسية في الزرد الكبار ، ليس فقط لأنه يتم حفظها عاليا هياكل الظهارية في جميع الفقاريات التي تمت دراستها ، ولكن أيضا لأن الزرد أخلاقي قادر على التجدد الهيدروجيني ، قدرة أن الثدييات تفقد بعد فترة قصيرة من الولادة. نستخدم الأذن الداخلية من الزرد الكبار ونظام نموذجي لدراسة آليات التجديد HC الداخلية الأذن في الفقاريات الكبار التي يمكن أن تكون مفيدة لعلاج السمع السريرية / العجز في ميزان الإنسان نتيجة لفقدان HC.
نحن هنا لشرح كيفية القيام بتشريح الجسيمة وغرامة قدرها ظهائر الأذن الداخلية الحسية في الزرد الكبار. تشريح الإجمالي إزالة الأنسجة المحيطة الأذن الداخلية ومفيد لإعداد أقسام الأنسجة ، والذي يتيح لنا أن دراسة هيكل تفصيلي للظهائر الحسية. تشريح غرامة ينظف أنسجة غير حسية الظهارية كل ظهارة الفردية وتمكننا من دراسة التباين في ظهارة كله بسهولة في كل جبل عينات بشرية.
Protocol
الجزء 1 : إعداد النسيج
- الموت ببطء والزرد مع الكبار مخزنة MS - 222 (3 الأثيل أمينوبنزوات الملح methanesulfonate ، 0.03 ٪).
- قطع رأس السمكة. قطع الفك السفلي ، ضع الرأس على منصة التشريح مع الجانب البطنية يصل ، ويشل النسيج مع دبابيس الحشرات. إزالة الأنسجة اللينة بطني في الجمجمة وكسر فتح جزء من بطني الكبسولة الجمجمة مع زوج من ملاقط غرامة تشريح تحت المجهر.
- حل رئيس الأسماك في بارافورمالدهيد (4 ٪) في 4 درجات مئوية خلال الليل.
- شطف الرأس الأسماك ثابتة في برنامج تلفزيوني (الفوسفات التخزين المؤقت المالحة ، 1X) لمدة 3 مرات ، 5 دقائق في كل مرة.
الجزء 2 : تشريح الإجمالي في الأذن الداخلية
- وضع رئيس الأسماك على منصة التشريح حتى مع الجانب البطني. شل مع دبابيس الحشرات. تتم جميع الخطوات التالية تحت مجهر تشريح.
- مع زوج من ملاقط غرامة ، وإزالة العظم الجمجمة فوق الأذن الداخلية ومن ثم سحب بعناية أنسجة الأذن الداخلية : الكييسات ، lagenae وutricles. والكييس lagena ويتم إرفاق بإحكام مع بعضها البعض ، وبالتالي سحب معا بينما utricle (الأمامي إلى الكييس وlagena) ، ومن المرجح جدا أن تكون منفصلة عن أجهزة الطرف الآخر أثناء تشريح.
- وضع أنسجة الأذن الداخلية في برنامج تلفزيوني (1X). اذا كانت هناك حاجة أي تشريح مزيد غرامة ، وشطف الأنسجة 2-3 مرات مع برنامج تلفزيوني (1X) ويمكن استخدامه لتجارب أخرى ، مثل cryosections.
الجزء 3 : تشريح الجميلة من ظهائر الأذن الداخلية الحسية
- ويمكن إجراء تشريح غرامة في قطرة من برنامج تلفزيوني (1X) على شريحة زجاجية نظيفة.
- إزالة otolith القريبي من utricle مع اثنين من أزواج من ملاقط دقيقة ، وإذا كان المطلوب ، وتقليم قبالة الأنسجة الطلائية غير الحسية وتعصيب للمن ظهائر مع زوج من ملاقط وغرامة شفرة الإبرة.
- إزالة otolith lagenar قبل التفرق والكييس ظهائر lagenar بينما محاولة للحفاظ على الكييس بأسرها سليمة قدر الإمكان. مكان النسيج في برنامج تلفزيوني مع انخفاض يصل الجانب البطني. استخدام إبر شفرة لقطع بعناية في كيس وبين lagena. تقليم قبالة المفرط غير الحسية الأنسجة الطلائية وinnvervation مع ملاقط الجميلة والنصل الإبرة ، وإذا رغبت في ذلك.
الجزء 4 : تلطيخ نيون للخلايا الشعر في ظهائر الحسية
- شطف ظهائر الحسية مع PBT (1XPBS وتريتون 1 ٪ X - 100) لمدة 3 مرات ، 5 دقائق في كل مرة.
- احتضان لظهائر مع fluophore المسمى phalloidin (مثل اليكسا طحين 488 Phalloidin ، 1:1،000 التخفيف) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف ظهائر الحسية مع PBT لمدة 3 مرات و 10 دقيقة في كل مرة.
- تحميل ظهائر على شريحة مع تصاعد المتوسطة والتحقق من النسيج الملون تحت المجهر الفلورسنت مع مرشحات من الطول الموجي المناسب.
- بعد تشريح ناجحة والتلوين ، ويمكن أن ينظر إلى ظهائر سليمة قوية مع ربطة الشعر تلوين الخلية تحت المجهر (الشكل 1).
الشكل 1. تم صبغ الشعر من خلايا ظهارة الحسية الكييس مع Phalloidin اليكسا 488 طحين (الأخضر) ، وكان تشريح عينات الأنسجة والملون على النحو المذكور في هذه الورقة. وقد اتخذت العديد من الصور في مواقع مختلفة من العينة ومزينة بالبلاط مع أدوبي فوتوشوب 7.0.
مقياس شريط = 150μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول ، وصفنا تشريح الجسيمة وغرامة من ظهائر الأذن الداخلية الحسية من الزرد الكبار ، والتي تمكننا من تحضير عينات الأنسجة لدراسة الخصائص الخلوية والتحت خلوية من ظهائر الحسية.
من أجل إجراء تشريح ناجحة ، فإن الخطوة الأولى للغاية ، التثبيت ، مهم جدا. تأكد من أن عليك دائما استخدام الطازجة بارافورمالدهيد حل لأن الحل القديمة سيؤدي إلى تثبيت تحت الأنسجة التي يصعب التعامل أثناء تشريح. ومع ذلك ، تأكد من ان كنت لا الإفراط في إصلاح الأنسجة من خلال ترك لهم في حل التثبيت لفترة طويلة جدا ، لأنه سوف تتداخل مع نتائج تلطيخ المناعة / النسيجي بعد تشريح. بالإضافة إلى ذلك ، حافظت جيدا باستخدام أدوات التشريح التي هي في الاحجام المناسبة أمر بالغ الأهمية أيضا ، وخاصة بالنسبة للتشريح الغرامة.
ويمكن أيضا هذا البروتوكول تشريح الإجمالي يمكن تكييفها للحصول على أنسجة الأذن الداخلية لاستخراج أنسجة محددة السلطات الوطنية المعينة / الرناوات / البروتينات. في هذه الحالة ، ينبغي أن يتم تشريح الحق في الخروج بعد التضحية من الأسماك من دون تثبيت بارافورمالدهيد. بالإضافة ، يمكن استخدام أساليب روتينية معينة لحماية وتدهور الجزيئات المستهدفة. على سبيل المثال ، يمكن أن تشطف الرأس الأسماك (الفك السفلي إزالة) ثم ومغمورة في حل RNAlater (Ambion) أثناء تشريح للأنسجة محددة استخراج الحمض النووي الريبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من قبل برنامج بحوث جماعية للمجلس الوطنى لمعهد بحوث الجينوم البشرية والمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Reagent | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| PBS (Phosphate-buffered Saline, 10X) | Reagent | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Reagent | Invitrogen | A12379 | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | Reagent | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Dissection microscope | Microscope | Nikon Instruments | SMZ1000 | |
| Insect pins | Tool | Fine Science Tools | 26000-40 | |
| Scissors | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
| Tweezers | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045 | |
| Needle blade | Tool | Sharpoint | 78-6810 | |
| Fluorescent microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 200M | |
| Dissection pad | Tool | eNasco | SB07840M | |
| Zebrafish | Animal | Various | n/a |
