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Biology

格罗斯和精细解剖内耳感觉上皮细胞在成年斑马鱼(斑马鱼

doi: 10.3791/1211 Published: May 8, 2009

Summary

成年斑马鱼的内耳感觉上皮是一个良好的模型系统,为了解在成年脊椎动物的毛细胞再生的机制。此协议表明的上皮细胞的精细解剖,我们可以通过它获得组织样本,研究在细胞和亚细胞水平的再生事件。

Abstract

感觉神经上皮细胞在内耳的听觉和平衡功能的关键结构。因此,重要的是了解,这主要是两种类型的细胞组成的上皮细胞和分子特征:毛细胞(HCS)和支持细胞(SCS)。在这里,我们选择研究的内耳感觉上皮细胞在成年斑马鱼不仅的上皮结构,因为在所有研究的脊椎动物是高度保守的,但也因为成年斑马鱼能够再生HCS,有能力的哺乳动物出生后失去不久。作为一个模型系统,研究可能有助于为临床治疗人类慧聪损失的听觉/平衡赤字的成年脊椎动物内耳HC再生机制,我们使用的成年斑马鱼的内耳。

在这里,我们将演示如何在成年斑马鱼的内耳感觉上皮的毛保费及精细解剖。总清扫删除周围的内耳组织,并准备组织切片,这使得我们可以研究的感觉上皮细胞的详细结构。罚款清扫清理每一个人的上皮细胞的非感觉上皮组织,使我们能够在整个安装的上皮细胞样本研究整个上皮细胞的异质性很容易。

Protocol

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第1部分:组织准备

  1. 安乐死的成年斑马鱼缓冲的MS - 222(甲酸乙酯3 - 氨基磺酸盐,0.03%)。
  2. 杀头的鱼。切断下颌,头部腹侧的夹层垫,带虫针固定的组织。取出头骨腹软组织和一双细镊子显微镜下解剖,打开颅骨囊腹侧部分。
  3. 鱼头中的多聚甲醛(4%),固定在4 ° C过夜。
  4. 在PBS冲洗固定鱼嘴(磷酸盐缓冲液,1X)3次,每次5分钟。

第2部分:内耳毛夹层

  1. 夹层板与腹侧的一面朝上放置在鱼头。固定与昆虫引脚。以下所有步骤都进行了解剖显微镜下。
  2. 一双细镊子,在内耳中删除的颅底骨,然后小心地拉出内耳组织:saccules,lagenae,utricles。球囊和lagena紧密地连接到对方,从而一起拉出,而囊(前球囊和lagena),将很可能是从另一端机关在夹层分离。
  3. 放入PBS(1X)的内耳组织。如果没有进一步的罚款清扫是必要的,冲洗的组织,用PBS(1X)的2-3倍,并可以用于其他的实验,如冰冻切片。

第3部分:内耳感觉上皮细清扫

  1. 在一个洁净的载玻片上滴了PBS(1X),可以进行精细解剖。
  2. 椭圆囊耳石从囊中取出,用细镊子两个对,如果需要,剪掉了一双细镊子和针刀片非感觉上皮组织的上皮细胞的神经支配。
  3. 前分离囊状和lagenar上皮细胞,同时尽量保持尽可能完好的整体球囊取出lagenar耳石。将中腹的一面向上的PBS下降组织。使用的针头,刀片之间的球囊和lagena仔细削减。修剪过度的非感官的上皮组织和innvervation用细镊子和刀片针,如果需要的话。

第4部分:在感觉上皮的毛细胞荧光染色

  1. 冲洗感觉上皮细胞与PBT(1XPBS和1%的Triton X - 100)3次,每次5分钟。
  2. 孵育fluophore与上皮细胞标记的鬼笔环肽(如Alexa的面粉488鬼笔环肽,1:1,000稀释)在室温下30分钟。
  3. 感觉上皮冲洗3次,每次10分钟,与PBT。
  4. 装载到安装介质中的幻灯片的上皮细胞,并在适当波长滤波器的荧光显微镜检查染色组织。
  5. 成功清扫和染色后,可以看到完整的上皮细胞具有很强的毛细胞束染色,在显微镜下(图1)。

图1
图1。囊状感觉上皮的毛细胞染色与Alexa的面粉488鬼笔环肽(绿色 ),解剖和染色的文件中提到的组织样本。一些照片拍摄于样品的不同位置,与Adobe Photoshop 7.0和瓷砖。
比例尺=150μm的。

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Discussion

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在这个协议中,我们描述的内耳感觉上皮细胞的成年斑马鱼,研究的感官上皮细胞和亚细胞的功能,使我们准备组织样本的总罚款清扫。

为了开展一个成功的解剖,第一步,固定的,是非常重要的。确保您始终使用新鲜配制的多聚甲醛溶液,因为旧的解决方案将导致是很难处理过程中剥离的组织下,固定。但是,请确保您不要过度修复组织,由他们留在固定时间过长的解决方案,因为它会干扰免​​疫/组织学染色剥离后的结果。此外,使用以及良好的保持清扫工具,在适当的大小是至关重要的,尤其是优良的剥离。

这也可以改编为获得组织特异性的DNA / RNA分子/蛋白提取内耳组织总清扫协议。在这种情况下,应进行解剖后没有多聚甲醛固定的鱼牺牲。此外,某些常规方法可用于保护目标大分子的降解。例如,鱼嘴(较低颚删除)可以冲洗,然后沉浸在RNAlater溶液(Ambion公司)在解剖组织特异性的RNA提取。

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Acknowledgments

这项研究是由国家人类基因组研究所,美国国立卫生研究院院内研究计划的支持。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) Reagent Sigma-Aldrich A5040
PBS (Phosphate-buffered Saline, 10X) Reagent Mediatech, Inc. 46-013-CM
Paraformaldehyde Reagent Sigma-Aldrich P-6148
Triton X-100 Reagent Sigma-Aldrich T8787
Alexa Fluor 488 phalloidin Reagent Invitrogen A12379
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI Reagent Vector Laboratories H-1500
Dissection microscope Microscope Nikon Instruments SMZ1000
Insect pins Tool Fine Science Tools 26000-40
Scissors Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5880
Tweezers Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5045
Needle blade Tool Sharpoint 78-6810
Fluorescent microscope Microscope Carl Zeiss, Inc. Axiovert 200M
Dissection pad Tool eNasco SB07840M
Zebrafish Animal Various n/a

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格罗斯和精细解剖内耳感觉上皮细胞在成年斑马鱼(<em>斑马鱼</em>)
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Liang, J., Burgess, S. M. Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio). J. Vis. Exp. (27), e1211, doi:10.3791/1211 (2009).More

Liang, J., Burgess, S. M. Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio). J. Vis. Exp. (27), e1211, doi:10.3791/1211 (2009).

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