Gross och Fine dissekering av Inner Ear Sensorisk epitel i Vuxen Zebrafish ( Danio rerio)

Summary

Innerörat sensoriska epitelet av vuxna zebrafisk är en bra modell för att förstå de mekanismer av hår cellförnyelsen i vuxen ryggradsdjur. Detta protokoll visar fina dissekering av epitel, genom vilken vi kan få vävnadsprover för att studera regenerativ händelserna på cellulär och subcellulära nivåer.

Abstract

Neurosensoriska epitel i innerörat är de avgörande strukturer för hörsel och balans funktioner. Därför är det viktigt att förstå den cellulära och molekylära funktioner i epitel, som huvudsakligen består av två typer av celler: hårceller (HCS) och stödjande celler (SCS). Här har vi väljer att studera i innerörat sensoriska epitel hos vuxna zebrafisk inte bara för att de epiteliala strukturer är starkt konservativa i alla studerade ryggradsdjur, men också för att den vuxna zebrafisk kan regenerera HC, en förmåga som däggdjur förlorar strax efter födseln. Vi använder innerörat hos vuxna zebrafisk som modellsystem för att studera mekanismerna bakom innerörat HC förnyelse i vuxen ryggradsdjur som kan vara till hjälp för klinisk behandling av hörsel / balans underskott i mänskligt som ett resultat av HC förlust.

Här visar vi hur du gör grova och fina dissektioner av innerörat sensoriska epitel i vuxen zebrafisk. Bruttomarginalen dissektion tar bort vävnad som omger innerörat och är till hjälp för att förbereda vävnadssnitt, som tillåter oss att undersöka den närmare strukturen i sensoriska epitel. Den fina dissektion rensar upp den icke-sensoriska-epitelvävnader för varje enskild epitel och ger oss möjlighet att undersöka heterogenitet av hela epitelet lätt i hela montering epiteliala prover.

Protocol

Del 1: Förberedelser av vävnaden

1. Euthanize den vuxne zebrafisk med buffrad MS-222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt, 0,03%).
2. Halshugga fisken. Skär av underkäken, placera huvudet på dissekering pad med den ventrala sidan uppåt och immobilisera vävnaden med insekt stift. Ta bort den mjuka vävnaden ventrala till skallen och spricka öppna den ventrala delen av skallen kapseln med ett par fina pincett under en dissektion mikroskop.
3. Fäst fisken huvudet i paraformaldehyd (4%) vid 4 ° C över natten.
4. Skölj den fasta fisken huvudet i PBS (fosfatbuffrad saltlösning, 1X) för 3 ggr, 5 minuter varje gång.

Del 2: Gross dissekering av innerörat

1. Placera fisken huvudet på dissekering pad med den ventrala sidan uppåt. Immobilisera den med insekter stift. Alla följande steg utföras under dissektion mikroskop.
2. Med ett par fina pincett, ta bort skallbenet över innerörat och sedan försiktigt dra ut innerörat vävnader: saccules, lagenae och utricles. Den saccule och Lagena är fästa tätt till varandra och på så sätt dra ut tillsammans medan utricle (anterior till saccule och Lagena), kommer troligtvis att bli befriad från den andra änden organ under dissektion.
3. Sätt innerörat vävnaderna i PBS (1X). Om ingen ytterligare fina dissektion behövs, skölj vävnaden 2-3 gånger med PBS (1X) och det kan användas till andra experiment, t ex kryosnitt.

Del 3: Fine dissekering av innerörat sensoriska epitel

1. Den fina dissektion kan utföras i en droppe PBS (1X) på en ren glasskiva.
2. Ta bort utricular otolith från utricle med två par fina pincett, och om så önskas, trimma bort de icke-sensoriska epitelvävnad och innervationen från epitel med ett par fina pincett och en nål blad.
3. Ta bort lagenar otolith innan separera saccular och lagenar epitel samtidigt försöka hålla hela saccule så intakt som möjligt. Placera vävnad i PBS droppe med ventrala sidan uppåt. Använd nålen bladet att noggrant skära in mellan saccule och Lagena. Klipp av det alltför stora icke-sensoriska epitelvävnad och innvervation med fin pincett och nålen blad, om så önskas.

Del 4: Fluorescerande färgning av hårcellerna i sensoriska epitel

1. Skölj sensoriska epitel med PBT (1XPBS och 1% Triton X-100) för 3 ggr, 5 min varje gång.
2. Inkubera epitel med fluophore-märkt phalloidin (t.ex. Alexa Mjöl 488 Phalloidin, 1:1,000 utspädning) i 30 minuter vid rumstemperatur.
3. Skölj sensoriska epitel med PBT för 3 gånger, 10 min varje gång.
4. Montera epitel på en bild med monteringsmedium och kontrollera färgade vävnad under fluorescerande mikroskop med filter av rätt våglängd.
5. Efter en lyckad dissektion och färgning kan intakt epitel med starka hårcell bunt färgning ses under mikroskop (Fig. 1).

Figur 1. Hårcellerna i saccular sensoriska epitelet färgades med Alexa Mjöl 488 Phalloidin (grön). Var dissekeras och färgas som nämns i uppsatsen vävnadsprovet. Flera bilder togs vid olika positioner av provet och kaklade tillsammans med Adobe Photoshop 7.0.
Skala bar = 150μm.

Discussion

I detta protokoll beskrivs vi de grova och fina dissekering av innerörat sensoriska epitel av vuxna zebrafisk, vilket gör att vi kan förbereda vävnadsprov för att studera de cellulära och subcellulära funktioner i sensoriska epitel.

För att kunna genomföra en framgångsrik dissektion, det allra första steget, fixering, är mycket viktigt. Se till att du alltid använder nygjord paraformaldehyd lösning eftersom gamla lösningen kommer att resultera i under-fixeringen av vävnader som är svåra att hantera under dissekering. Men se till att du inte över-fix i vävnaderna genom att lämna dem till upptagning lösningen för länge, eftersom det kommer att påverka resultatet av immunförsvaret / histologiska färgning efter dissekering. Dessutom, med hjälp av välskötta dissektion verktyg som är i lämplig storlek är avgörande också, speciellt för de fina dissekering.

Denna grova dissektion protokoll kan även anpassas för att förvärva innerörat vävnader för utvinning av vävnad-specifika DNA / RNA / protein. I så fall bör dissektion göras direkt efter offret av fisk utan paraformaldehyd fixering. Dessutom kan vissa rutinmässiga metoder användas för att skydda den nedbrytning av målet makromolekyler. Till exempel kan fisken huvud (nedre käke bort) sköljas och sedan nedsänkt i RNAlater lösning (Ambion) under dissektion av vävnad-specifika RNA-extraktion.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Reagent	Sigma-Aldrich	A5040
PBS (Phosphate-buffered Saline, 10X)	Reagent	Mediatech, Inc.	46-013-CM
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P-6148
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787
Alexa Fluor 488 phalloidin	Reagent	Invitrogen	A12379
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI	Reagent	Vector Laboratories	H-1500
Dissection microscope	Microscope	Nikon Instruments	SMZ1000
Insect pins	Tool	Fine Science Tools	26000-40
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
Tweezers	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5045
Needle blade	Tool	Sharpoint	78-6810
Fluorescent microscope	Microscope	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 200M
Dissection pad	Tool	eNasco	SB07840M
Zebrafish	Animal	Various	n/a