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Biology

Gross und Fine Dissection of Inner Ear Sinnesepithelien in Adult Zebrafisch ( Danio rerio)

doi: 10.3791/1211 Published: May 8, 2009

Summary

Das Innenohr Sinnesepithel der erwachsenen Zebrafisch ist ein gutes Modell für das Verständnis der Mechanismen der Haare Zellregeneration bei erwachsenen Wirbeltieren. Dieses Protokoll zeigt die feinen Sezierung der Epithelien, durch die wir Gewebeproben zur Untersuchung der regenerativen Veranstaltungen auf zellulärer und subzellulärer Ebene können.

Abstract

Neurosensorische Epithelien im Innenohr sind die entscheidenden Strukturen für die Hör-und Gleichgewichtsstörungen Funktionen. Daher ist es wichtig, die zellulären und molekularen Eigenschaften der Epithelien, die vor allem von zwei Arten von Zellen zusammengesetzt sind zu verstehen: Haarzellen (HC) und Stützzellen (SCS). Hier wählen wir an das Innenohr Sinnesepithelien bei erwachsenen Zebrafisch nicht nur studieren, weil der epithelialen Strukturen stark in allen Wirbeltieren studiert konserviert sind, sondern auch, weil die erwachsenen Zebrafisch ist in der Lage, Kohlenwasserstoffe, eine Fähigkeit, die Säugetiere verlieren kurz nach der Geburt zu regenerieren. Wir verwenden das Innenohr von adulten Zebrafisch als Modellsystem, um die Mechanismen des Innenohrs HC Regeneration bei erwachsenen Wirbeltieren, die hilfreich für die klinische Therapie des Hörens / Balance Defizite in der menschlichen als Folge der HC Verlust könnte zu studieren.

Hier zeigen wir, wie auf grobe und feine Sezieren des Innenohres Sinnesepithelien bei erwachsenen Zebrafisch zu tun. Der Brutto-Dissektion entfernt die umgebenden Gewebe des Innenohrs und ist hilfreich für die Vorbereitung Gewebeschnitten, die uns die detaillierte Struktur der Sinnesepithelien untersuchen können. Die feinen Sezierung bereinigt die nicht sensorisch-epithelialen Geweben der einzelnen Epithel und ermöglicht es uns, die Heterogenität der ganzen Epithel leicht prüfen, in ganz-mount epithelialen Proben.

Protocol

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Teil 1: Vorbereitung des Gewebes

  1. Euthanize der erwachsenen Zebrafisch mit gepufferter MS-222 (Ethyl-3-Aminobenzoesäure Methansulfonat Salz, 0,03%).
  2. Enthaupten die Fische. Schneiden Sie den Unterkiefer, platzieren Sie den Kopf auf die Zerlegung Pad mit der Bauchseite auf und fixieren das Gewebe mit Insekten Pins. Entfernen Sie die Weichteile ventral auf den Schädel und knacken den ventralen Teil des Schädels Kapsel mit einer feinen Pinzette unter einer Dissektionsmikroskop.
  3. Fix der Fischkopf in Paraformaldehyd (4%) bei 4 ° C über Nacht.
  4. Spülen Sie den festen Fischkopf in PBS (Phosphate Buffered Saline, 1x) für 3-mal, jeweils 5 Minuten Zeit.

Teil 2: Gross Dissektion des Innenohrs

  1. Den Fisch den Kopf auf die Zerlegung Pad mit der Bauchseite nach oben. Immobilisieren sie mit Insekten Pins. Alle folgenden Schritte werden unter der Dissektionsmikroskop durchgeführt.
  2. Mit einer feinen Pinzette, entfernen Sie die Schädelknochen über das Innenohr und dann vorsichtig herausziehen Innenohrgeweben: Säckchen, lagenae und Schläuchen. Der Sacculus und Lagena sind eng miteinander verbinden und so ziehen zusammen, während der Schlauch (anterior des Sacculus und Lagena), wird sehr wahrscheinlich vom anderen Ende Organe während der Präparation gelöst werden.
  3. Legen Sie die Innenohrgeweben in PBS (1x). Wenn keine weiteren feinen Sezierung erforderlich ist, spülen Sie das Gewebe 2-3 mal mit PBS (1x) und es kann auch für andere Experimente, z. B. Gefrierschnitte verwendet werden.

Teil 3: Fine Dissektion des Innenohrs Sinnesepithelien

  1. Die feinen Sezierung kann in einem Tropfen PBS (1x) auf einen sauberen Glasobjektträger durchgeführt werden.
  2. Entfernen Sie die Utriculardrüsen Otolithen aus dem Utriculus mit zwei Paaren von feinen Pinzette, und, falls gewünscht, schneiden Sie die nicht-sensorische Epithelgewebe und die Innervation der Epithelien mit einer feinen Pinzette und eine Nadel Klinge.
  3. Entfernen Sie die lagenar Otolithen vor der Trennung saccular und lagenar Epithelien während versuchen, die ganze Sacculus so intakt wie möglich zu halten. Legen Sie das Gewebe in der PBS-drop mit Bauchseite auf. Verwenden Sie die Nadel Klinge sorgfältig zwischen den Sacculus und Lagena geschnitten. Schneiden Sie die übermäßige non-sensorischen Epithel-Gewebe und die innvervation mit feinen Pinzette und Nadel Klinge, falls gewünscht.

Teil 4: Fluoreszenzfärbung der Haarzellen in der Sinnesepithelien

  1. Spülen Sie den Sinnesepithelien mit PBT (1XPBS und 1% Triton X-100) für 3-mal, jeweils 5 min.
  2. Inkubieren Sie die Epithelien mit fluophore-markiertem Phalloidin (zB Alexa Flour 488 Phalloidin, 1:1000 verdünnt) für 30 min bei Raumtemperatur.
  3. Spülen Sie den Sinnesepithelien mit PBT für 3-mal, jeweils 10 Minuten Zeit.
  4. Montieren Sie die Epithelien auf eine Folie mit Eindeckmedium und überprüfen Sie die gefärbten Gewebeschnitten unter dem Fluoreszenz-Mikroskop mit Filtern der richtigen Wellenlänge.
  5. Nach der erfolgreichen Präparation und Färbung, können intakte Epithelien mit starken Haarzelle Bündel Färbung unter dem Mikroskop (Abb. 1) zu sehen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Haarzellen des sackförmigen Sinnesepithel wurden mit Alexa Flour 488 Phalloidin (grün) gefärbt. Die Gewebeprobe wurde seziert und gefärbt wie in der Zeitung erwähnt. Mehrere Bilder wurden an verschiedenen Stellen der Probe entnommen und gefliesten zusammen mit Adobe Photoshop 7.0.
Maßstab = 150 um.

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Discussion

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In diesem Protokoll beschrieben wir die grobe und feine Zerlegung des Innenohrs Sinnesepithelien der erwachsenen Zebrafisch, die uns Gewebeprobe zur Untersuchung der zellulären und subzellulären Eigenschaften der Sinnesepithelien vorbereiten können.

Um die Durchführung einer erfolgreichen Präparation der allererste Schritt, Fixierung, ist sehr wichtig. Stellen Sie sicher, dass Sie immer frisch zubereitet Paraformaldehydlösung weil alte Lösung in unter-Fixierung der Gewebe, die schwer zu während der Dissektion handhaben sind zur Folge hat. Stellen Sie jedoch sicher, dass Sie nicht über-fix das Gewebe, indem man sie in der Fixierung Lösung für zu lang, weil sie mit den Ergebnissen des Immunsystems / histologischen Färbung nach dem Sezieren nicht beeinträchtigen. Darüber hinaus verwenden gepflegten Dissektion Tools, die in entsprechenden Größen sind entscheidend ist auch, insbesondere für die feinen Sezierung.

Diese grobe Zerlegung Protokoll kann auch für den Erwerb Innenohrgeweben für die Extraktion von Gewebe-spezifische DNA / RNA / Protein angepasst werden. In diesem Fall sollte die Präparation direkt nach der Opferung der Fisch ohne Paraformaldehyd Fixierung durchgeführt werden. Darüber hinaus können bestimmte Routine-Methoden verwendet, um den Abbau der Ziel-Makromoleküle zu schützen. Zum Beispiel kann der Fisch den Kopf (unten Kiefer entfernt) gespült und dann in die RNAlater-Lösung (Ambion) eingetaucht während der Präparation für die Gewebe-spezifische RNA-Extraktion.

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Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch die Interne Research Program des National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health unterstützt.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) Reagent Sigma-Aldrich A5040
PBS (Phosphate-buffered Saline, 10X) Reagent Mediatech, Inc. 46-013-CM
Paraformaldehyde Reagent Sigma-Aldrich P-6148
Triton X-100 Reagent Sigma-Aldrich T8787
Alexa Fluor 488 phalloidin Reagent Invitrogen A12379
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI Reagent Vector Laboratories H-1500
Dissection microscope Microscope Nikon Instruments SMZ1000
Insect pins Tool Fine Science Tools 26000-40
Scissors Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5880
Tweezers Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5045
Needle blade Tool Sharpoint 78-6810
Fluorescent microscope Microscope Carl Zeiss, Inc. Axiovert 200M
Dissection pad Tool eNasco SB07840M
Zebrafish Animal Various n/a

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Liang, J., Burgess, S. M. Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio). J. Vis. Exp. (27), e1211, doi:10.3791/1211 (2009).More

Liang, J., Burgess, S. M. Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio). J. Vis. Exp. (27), e1211, doi:10.3791/1211 (2009).

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