Dissezione lordo e Arti di epiteli sensoriali dell'orecchio interno in adulti Zebrafish ( Danio rerio)

Summary

L'epitelio dell'orecchio interno sensoriale del pesce zebra adulta è un sistema di buon modello per la comprensione dei meccanismi di rigenerazione delle cellule dei capelli nei vertebrati adulti. Questo protocollo dimostra la dissezione belle degli epiteli, attraverso il quale possiamo ottenere campioni di tessuto per lo studio degli eventi rigenerativi a livello cellulare e subcellulare.

Abstract

Epiteli neurosensoriale nell'orecchio interno sono le strutture fondamentali per le funzioni dell'udito e dell'equilibrio. Pertanto, è importante capire le caratteristiche cellulari e molecolari degli epiteli, che sono principalmente composti da due tipi di cellule: cellule ciliate (HC) e le cellule di supporto (SC). Qui abbiamo scelto di studiare gli epiteli sensoriali dell'orecchio interno in zebrafish adulti non solo perché le strutture epiteliali sono altamente conservati in tutti i vertebrati studiati, ma anche perché il pesce zebra adulto è in grado di rigenerare HC, una capacità che i mammiferi perdere poco dopo la nascita. Usiamo l'orecchio interno di zebrafish adulti come sistema modello per studiare i meccanismi di rigenerazione dell'orecchio interno HC nei vertebrati adulti che potrebbero essere utili per la terapia clinica dell'udito / deficit in equilibrio umano a causa della perdita di HC.

Qui mostriamo come fare dissezioni lordo e multa di epiteli sensoriali dell'orecchio interno in zebrafish adulti. La dissezione lordo rimuove i tessuti circostanti l'orecchio interno ed è utile per la preparazione di sezioni di tessuto, che ci permette di esaminare la struttura dettagliata degli epiteli sensoriali. La dissezione multa pulisce il non-senso-tessuti epiteliali epitelio di ogni individuo e ci permette di esaminare l'eterogeneità dell'epitelio tutto facile per intero-mount campioni epiteliali.

Protocol

Parte 1: Preparazione del tessuto

1. Euthanize il pesce zebra adulti con tamponata MS-222 (3-etil aminobenzoate sale metanosolfonato, 0,03%).
2. Decapitare il pesce. Tagliare la mascella inferiore, posizionare la testa sul pad dissezione con il lato ventrale, e immobilizzare il tessuto con perni insetti. Rimuovere il tessuto molle ventrale al cranio e crack aprire la parte ventrale della capsula cranio con un paio di pinzette bene al microscopio di dissezione.
3. Fissare la testa di pesce in paraformaldeide (4%) a 4 ° C durante la notte.
4. Sciacquare la testa fissa pesce in PBS (Phosphate Buffered Saline, 1X) per 3 volte, a 5 minuti ogni volta.

Parte 2: dissezione lordo dell'orecchio interno

1. Posizionare la testa di pesce sul pad dissezione con l'alto lato ventrale. Immobilizzarla con i perni di insetti. Tutte le fasi che seguono sono svolte sotto il microscopio di dissezione.
2. Con un paio di pinzette fine, togliere l'osso del cranio sopra l'orecchio interno e quindi estrarre delicatamente i tessuti dell'orecchio interno: sacculi, lagenae e otricoli. Il sacculo e lagena sono strettamente collegare gli uni agli altri e quindi tirare fuori insieme mentre il utricolo (anteriore al sacculo e lagena), molto probabilmente per essere distaccato dagli organi altra estremità durante la dissezione.
3. Mettete i tessuti dell'orecchio interno in PBS (1X). Se non dissezione ulteriore fine è necessario, lavare il tessuto 2-3 volte con PBS (1X) e può essere utilizzato per altri esperimenti, criosezioni ad es.

Parte 3: dissezione fine degli epiteli sensoriali dell'orecchio interno

1. La dissezione multa può essere effettuata in una goccia di PBS (1X) su un vetrino pulito.
2. Rimuovere il otoliti utricular dal utricolo con due paia di pinzette fine, e, se necessario, tagliare la non-sensoriale tessuto epiteliale e l'innervazione dal epiteli con un paio di pinzette e una lama sottile ago.
3. Rimuovere il otoliti lagenar prima di separarsi sacculare e lagenar epiteli, mentre cercate di mantenere il sacculo tutto il più intatto possibile. Posizionare il tessuto in calo PBS fino lato ventrale. Usare la lama per tagliare l'ago con attenzione tra il sacculo e lagena. Tagliare l'eccesso non-sensoriale tessuto epiteliale e la innvervation con le pinzette e la lama sottile ago, se lo si desidera.

Parte 4: colorazione fluorescente delle cellule ciliate della epiteli sensoriali

1. Sciacquare gli epiteli sensoriali con PBT (1XPBS e 1% Triton X-100) per 3 volte, 5 minuti ogni volta.
2. Incubare gli epiteli con fluophore marcato falloidina (ad esempio 488 Farina Alexa falloidina, diluizione 1:1000) per 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Sciacquare gli epiteli sensoriali con PBT per 3 volte, a 10 min ogni volta.
4. Montare il epiteli su un vetrino con il montaggio di medie e controllare il tessuto colorato sotto il microscopio a fluorescenza con filtri della lunghezza d'onda appropriata.
5. Dopo la dissezione di successo e colorazione, epiteli intatto con una forte colorazione fascio di cellule dei capelli può essere visto al microscopio (Fig. 1).

Figura 1. Cellule ciliate dell'epitelio sacculare sensoriali sono state colorate con farina di Alexa 488 falloidina (Verde). Il campione di tessuto è stato dissezionato e macchiato, come indicato nel documento. Diverse immagini sono state scattate in diverse posizioni del campione e piastrellato con Adobe Photoshop 7.0.
Barra di scala = 150μm.

Discussion

In questo protocollo, abbiamo descritto la dissezione lordo e fine degli epiteli sensoriali dell'orecchio interno di zebrafish per adulti, che ci permette di preparare i campioni di tessuto per lo studio della funzionalità cellulare e subcellulare degli epiteli sensoriali.

Al fine di realizzare una dissezione di successo, il primo passo, la fissazione, è molto importante. Assicurarsi di utilizzare sempre la soluzione paraformaldeide preparata perché vecchia soluzione si tradurrà in sotto-fissazione dei tessuti che sono difficili da gestire durante la dissezione. Tuttavia, assicurarsi di non fissare il sovra-tessuti lasciandoli nella soluzione di fissaggio per troppo tempo, perché essa possa interferire con i risultati della colorazione immunitario / istologici dopo la dissezione. Inoltre, utilizzando ben tenuta strumenti dissezione che sono dimensioni adeguate è fondamentale e, soprattutto per la dissezione fine.

Questo protocollo dissezione lordo può essere adattato anche per l'acquisizione di tessuti dell'orecchio interno per l'estrazione di tessuto-specifici DNA / RNA / proteine. In tal caso, la dissezione deve essere effettuata subito dopo il sacrificio del pesce senza fissazione paraformaldeide. Inoltre, i metodi di routine alcune possono essere usati per proteggere la degradazione delle macromolecole di destinazione. Per esempio, la testa di pesce (in basso a mascella rimossi) possono essere risciacquati e poi immerso nella soluzione RNAlater (Ambion) durante la dissezione di tessuto-specifica l'estrazione di RNA.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Reagent	Sigma-Aldrich	A5040
PBS (Phosphate-buffered Saline, 10X)	Reagent	Mediatech, Inc.	46-013-CM
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P-6148
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787
Alexa Fluor 488 phalloidin	Reagent	Invitrogen	A12379
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI	Reagent	Vector Laboratories	H-1500
Dissection microscope	Microscope	Nikon Instruments	SMZ1000
Insect pins	Tool	Fine Science Tools	26000-40
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
Tweezers	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5045
Needle blade	Tool	Sharpoint	78-6810
Fluorescent microscope	Microscope	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 200M
Dissection pad	Tool	eNasco	SB07840M
Zebrafish	Animal	Various	n/a